Phát triển và ứng dụng kỹ thuật pcr đa mổl trong chẩn đoán e. coli gây tiêu chảy từ phân
Kỹ thuật PCR đa mồi lần đầu tiên được nghiên cứu thành công ở Việt nam bằng cách phối hợp 8 cặp mồi để chẩn đoán 5 loại E. coli gây tiêu chảy (ETEC, EHEC, EIEC, EPEC, EAEC) từ phân trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy. Kỹ thuật này cho phép chẩn đoán chính xác 5 loại E. coli gây tiêu chảy chỉ bằng một phản ứng PCR với đô nhạy và đô đặc hiệu gần 100% và tiết kiệm nguyên vật liệu, thời gian gấp 5 lần so với tiến hành từng phản ứng PCR riêng biệt. Qua phân tích 310 bệnh phẩm phân tiêu chảy, 90 chủng E. coli gây bệnh đã được phân lập chiếm 29,04% tổng số’ các bệnh phẩm. Trong đó, EAEC là 58 chủng chiếm 18,71%, ETEC 2 chủng (0,65%), EPEC 24 chủng (7,7%), và EIEC 6 chủng (1,94%).
Tiêu chảy là một vấn đề sức khoẻ toàn cầu. Bênh hay gặp ở trẻ em. Ớ các nước đang phát triển, có ít nhất 1 tỷ trường hợp tiêu chảy hàng năm và số tử vong là 5 đến 7 triệu. Trung bình một năm một trẻ mắc 3,3 lần tiêu chảy. Tại Việt Nam, một số’ nghiên cứu cho thấy, số’ lần bị tiêu chảy trong một năm đối với một trẻ từ 2,2 – 6. Tại các nước công nghiệp phát triển, tiêu chảy vần còn phổ biến ở trẻ em, người già và các khách du lịch đến các nước đang phát triển. Có nhiều nguyên nhân dần đến tiêu chảy. Trong đó, vi khuẩn đóng vai trò quan trọng.
Trong số các vi khuẩn gây tiêu chảy, E. coli hiện nay là căn nguyên nổi trội, thu hút được sự quan tâm của các bác sĩ lâm sàng, nhi khoa, vi sinh vì nó là căn nguyên của 1/3 số trường hợp tiêu chảy. Việc chẩn đoán gạp khó khăn vì các triệu chứng lâm sàng không đạc hiệu. Có 5 loại E. coli gây tiêu chảy, được phân loại theo các cơ chế gây bệnh khác nhau dựa trên các gien nằm trong tế bào vi khuẩn mã hoá cho các yếu tố độc lực: Enteropathogenic E. coli (EPEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC) và enteroaggregative E. coli (EAEC) [3, 4]. Hiện nay có bốn phương pháp được dùng để chẩn đoán các E. coli này:
• Dựa vào các tính chất sinh vật hoá học.
• Định týp huyết thanh.
• Các thử nghiệm dựa trên những đạc
điểm về độc lực.
Các phương pháp này hầu như không thể chẩn đoán được hoặc rất tốn kém.
• Các phương pháp sinh học phân tử:
+ Hiện nay chủ yếu là hai phương pháp: Mầu dò ADN (ADN probe) và phản ứng chuỗi (Pylymerase Chain Reaction – PCR). Tuy nhiên độ nhạy của phương pháp mầu dò ADN thấp, thao tác phức tạp và đòi hỏi một số lượng lớn vi sinh vật trong bênh phẩm.
+ PCR là kỹ thuật tổng hợp acid nucleic trong ống nghiêm. Trong đó, một đoạn ADN được nhân lên đạc hiệu. Trong kỹ thuật này, hai đoạn oligonucleotid, được gọi là mồi, gắn đạc hiệu vào đoạn ADN đích và được khuếch đại theo một số’ chu kỳ được lạp đi lạp lại. Chu kỳ này gồm việc làm tách hai sợi của đoạn ADN, gắn hai oligonucleotid vào hai sợi này theo nguyên tắc bổ sung và kéo dài đoạn oligonucleotid dưới tác động của enzym ADN polymerase. Trong PCR, ADN đích được tăng lên theo hàm số mũ sau mỗi chu kỳ. Sản phẩm của PCR được phát hiện sau khi điện di trên agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và đọc dưới ánh sáng đèn cực tím.
PCR là phương pháp đang được áp dụng rộng rãi vì cho kết quả nhanh, chính xác, độ nhạy và độ đạc hiệu cao. Hiện nay, trên thế’ giới, PCR đang được nghiên cứu và ứng dụng trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy. Bình thường trong một phản ứng PCR, người ta dùng một cạp mồi để khuếch đại một đoạn gien đạc hiệu. Để chẩn đoán xem trong bệnh phẩm có 1 trong số 5 loại E. coli gây tiêu chảy cẩn ít nhất 6 PCR riêng rẽ. Như vậy rất tốn kém. Vấn đề đạt ra là làm sao xác định được vi khuẩn này mà chỉ cẩn duy nhất 1 phản ứng PCR ? Nếu vậy, chúng ta không những tiết kiệm được nguyên vật liệu và thời gian mà còn tránh được sự nhiễm trong kỹ thuật này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm hai mục tiêu:
1. Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy.
Thông tin này hy vọng sẽ gợi mở cho các bạn hướng tìm kiếm và nghiên cứu hữu ích