Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2

Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2

Luận án tiến sĩ y học Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2.Interleukin (IL)-8, thuộc họ chemokin, là yếu tố tiền viêm đóng vai trò then chốt trong việc kích hoạt bạch cầu trung tính và liên quan đến các bệnh lý viêm như bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD), hen phế quản, vẩy nến hoặc viêm khớp dạng thấp.1 Nhiều bằng chứng cũng cho thấy IL-8 thúc đẩy sự hình thành mạch, tăng sinh, di chuyển, xâm lấn và di căn của tế bào ung thư phổi, vú, ruột kết, bàng quang, tuyến tiền liệt, gan, tử cung hay một dòng tế bào khối u khác.2,3 Vai trò IL-8 được thể hiện qua sự gắn kết với hai thụ thể kết hợp protein G (GPCR), là CXCR1 và CXCR2, tại vị trí hoạt động (orthosteric) ở ngoại bào. Bên cạnh đó, một vùng gắn kết dị lập thể nội bào (allosteric) cũng đã được phát hiện trong cấu trúc thực nghiệm của các phức hợp phối tử và GPCR.1,4-6 Các chất tác động ở vị trí allostericnội bào có thể điều chỉnh chức năng của thụ thể dẫn đến ảnh hưởng tới sự liên kết của phối tử nội sinh (IL-8) và GPCR (CXCR1/2).5 Do đó, tìm kiếm các chất gắn kết vào vị trí orthosteric hoặc allosteric, ngăn chặn tương tác IL-8/CXCR1/2, có thể là các chiến lược phát triển thuốc hiệu quả để phát hiện liệu pháp mới trong điều trị các bệnh lý kể trên.


Trong hai thập kỷ qua, một số kháng thể đơn dòng (ABX-IL8, HuMax IL-8), thuốc có nguồn gốc peptid (CXCL8 K11R G31P), acid nuleic (miR-155, miR-708) với đích tác động là IL-8/CXCR1/2 đã được nghiên cứu.5,7 Những liệu pháp sinh học này cho thấy điểm yếu không thể tránh khỏi như nguy cơ nhiễm khuẩn, chi phí cao và yêu cầu tiêm tĩnh mạch.8 Ngược lại, chất ức chế phân tử nhỏ với ưu điểm rẻ hơn và có thể được dùng bằng đường uống, các chất đối kháng phân tử nhỏ thụ thể CXCR1/2 (AZD5069, danirixin, elubrixin, navarixin, SX-682 hay reparixin) đã được khám phá và thử nghiệm lâm sàng.3-5,7,9 Tuy nhiên, những chất này đều tác động trên thụ thể tại vị trí allosteric và chưa có thuốc nào được phê duyệt điều trị hoặc một số thuốc đã thất bại trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng vì hiệu quả thấp (elubrixin hay danirixin trên bệnh nhân COPD, viêm ruột hay xơ nang) hoặc đặc tính dược động học kém (SX-56).5,10 Các nghiên cứu với cách tiếp cận dựa trên phối tử tại vị trí allosteric của nhóm tác giả Madea,11 Ha,12 Thái Khắc Minh13 hoặc Lê Minh Trí và cộng sự14 đã sử dụng mô hình tương đồng CXCR2 và thực hiện docking phân tử bằng cách dự đoán khoang gắn kết trên thụ thể hay nghiên cứu in silico của nhóm tác giả Boraek15 tiến hành docking mù trên toàn bộ IL-8. Theo đó, kết quả thu được ở những nghiên cứu trên cho thấy các ứng viên tiềm năng có cách thức tương tác khác nhau với CXCR211,12 hoặc tiềm năng gắn kết yếu trên IL-8.15 Hơn nữa, cho đến nay chưa có phân tử nhỏ ức chế IL-8/CXCR1/2 tại vị trí orthosteric được nghiên cứu và công bố với lý do chính đến từ việc thiếu cấu trúc thực nghiệm và thông tin tương tác trong phức hợp IL-8 và thụ thể tại vị trí này.4,6
Hiện nay, thiết kế thuốc có sự hỗ trợ của máy tính (CADD) hay còn gọi phương pháp in silico là công cụ hỗ trợ đắc lực, góp phần đẩy nhanh quá trình phát triển thuốc một cách hiệu quả hơn về chi phí cũng như giảm thiểu thất bại trong các giai đoạn thử nghiệm cuối.16 Trong CADD, thông tin cấu trúc protein là yếu tố cần thiết, đồng thời tỷ lệ sàng lọc các chất tiềm năng cao với ái lực gắn kết tốt đạt được khi xác định vị trí tương tác protein-protein (PPI).4Đáng chú ý, các cấu trúc phức hợp của IL-8 và CXCR1/2 được công bố (2020-2023) bằng các phương pháp hiện đại như tinh thể học tia X (X-ray) hoặc kính hiển vi điện tử đông lạnh (cryo-EM)6,17,18, là những cấu trúc có độ chính xác cao hơn so với mô hình tương đồng sử dụng trong nhiều nghiên cứu trước.11-14 Đồng thời, với các cấu trúc mới này, PPI tại những acid amin quan trọng (hot-spot/key residue}được xác định thông qua nghiên cứu thực nghiệm đột biến điểm.6,17,18 Đây là cơ sở cho nghiên cứu in silico dựa trên cấu trúc để sàng lọc các phân tử nhỏ tiềm năng ức chế IL-8/CXCR1/2 trước khi đưa vào thử nghiệm in vitro.Do vậy, đề tài “Sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế tương tác interleukin-8 và thụ thể CXCR1/2” được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu:
1.    Sàng    lọc    in    silico    các    cấu trúc phân tử nhỏ có    khả năng ức chế tương    tác
IL-8/CXCR1/2 tại vị trí hoạt động (orthosteric).
2.    Sàng    lọc    in    silico    các    cấu trúc phân tử nhỏ có    khả năng ức chế tương    tác
IL-8/CXCR2 tại vị trí dị lập thể (allosteric).
3.    Đánh giá khả năng ức chế tương tác IL-8/CXCR2 và ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL-8 của các chất tiềm năng bằng thử nghiệm in vitro.

MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN    i
LỜI CAM ĐOAN    iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH-VIỆT    viiii
DANH MỤC CÁC BẢNG    x
DANH MỤC CÁC HÌNH    xiiii
ĐẶT VẤN ĐỀ    1
Chương 1. TỔNG QUAN    TÀI    LIỆU    3
1.1.    Interleukin-8    3
1.2.    Nghiên cứu sàng lọc in    silico    13
1.3.    Thử nghiệm đánh giá hoạt tính in vitro    21
1.4.    Các nghiên cứu có liên quan đến đề tài    28
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU    34
2.1.    Thiết kế nghiên cứu    34
2.2.    Đối tượng nghiên cứu    35
2.3.    Thời gian và địa điểm nghiên cứu    36
2.4.    Phương pháp nghiên cứu    36
2.5.    Phương pháp phân tích dữ liệu    53
Chương 3. KẾT QUẢ    54
3.1.    Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế tương tác IL-8/CXCR1/2 tại vị
trí hoạt động (orthosteric)    54
3.2.    Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế tương tác IL-8/CXCR2 tại vị trí
dị lập thể (allosteric)    73
3.3.    Kết quả thử nghiệm đánh giá hoạt tính in vitro    82
Chương 4. BÀN LUẬN    88
4.1.    Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế tương tác IL-8/CXCR1/2 tại vị
trí hoạt động (orthosteric)    88
4.2.    Sàng lọc in silico các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế tương tác IL-8/CXCR2 tại vị trí
dị lập thể (allosteric)    105
4.3.    Thử nghiệm đánh    giá hoạt tính in vitro    109
KẾT LUẬN    122
KIẾN NGHỊ    124
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các dạng biến thể tự nhiên của IL-8    3
Bảng 1.2. Dữ liệu cấu trúc protein IL-8/CXCR1/2    5
Bảng 1.3. Tương tác giữa các acid amin của IL-8 và CXCR1/2 ở vị trí hoạt động    7
Bảng 1.4. Vai trò của IL8-CXCR1/2 trong một số nhóm bệnh chính    11
Bảng 1.5. Một số thuốc phân tử nhỏ ức chế CXCR1/2 allosterictrong giai đoạn
thử nghiệm lâm sàng    12
Bảng 1.6.    Một số    nghiên    cứu in    silico với mục tiêu IL-8/CXCR1/2    29
Bảng 1.7.    Một số    nghiên    cứu in    vitrođánh giá sự    gắn kết    31
Bảng 1.8.    Một số    nghiên    cứu in    vitrovề tác động    của IL-8 trên    tế bào ung thư    33
Bảng 2.1.    Phần mềm sử dụng trong nghiên cứu    36
Bảng 2.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu    37
Bảng 2.3. Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu    38
Bảng 2.4. Thành phần hỗn hợp dung dịch trong giếng đo    51
Bảng 3.1. Tóm tắt các mô hình docking phân tử trong nghiên cứu    57
Bảng 3.2. Các thư viện hợp chất được dùng để sàng lọc ảo    58
Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc qua các mô hình 3D-pharmacophore tìm chất gắn kết trên
IL-8    58
Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc qua các mô hình 3D-pharmacophore tìm chất gắn kết trên
CXCR1/2    59
Bảng 3.5. Các chất gắn kết trên CXCR2 có điểm số docking < -20 kJ.mol-1và sự tương tác    65
Bảng 3.6.    Kết    quả    dự đoán độc    tính của các    chất    72
Bảng 3.7.    Kết    quả    đánh giá mô    hình A    74
Bảng 3.8.    Kết    quả    đánh giá mô    hình B    74
Bảng 3.9.    Kết    quả    “redocking”    EBX vào    vị    trí gắn kết của CXCR2    76
Bảng 3.10. Các chất gắn kết trên CXCR2 với điểm số docking và sự tương tác tốt hơn
phối tử đồng kết tinh EBX    77
Bảng 3.11. Giá trị RMSF của các acid amin trong khoang gắn kết khi MDs phức hợp
ba phối tử với CXCR2    78
Bảng 3.12. Dự đoán ADMET của EBX và hai chất tiềm năng    80
Bảng 3.13. Kết quả đánh giá ức chế tương tác IL-8/CXCR2 của các chất thử nghiệm
tại nồng độ 100 pM    82
Bảng 4.1. Một số nghiên cứu sàng lọc SMPPII sử dụng mô hình pharmacophore
dựa trên PPI    90
Bảng 4.2. Nghiên cứu gắn kết docking phân tử trên mục tiêu IL-8    93
Bảng 4.3. Kết quả sàng lọc in silico ở nghiên cứu hiện tại và các nghiên cứu đã
công bố    107
Bảng 4.4. Các nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế gắn kết    111
Bảng 4.5. Các nghiên cứu về sự tăng sinh tế bào ung thư tuyến tiền liệt do IL-8
kích thích    112
Bảng 4.6. Các nghiên cứu về sự tăng sinh của một số dòng tế bào ung thư qua
trung gian IL-8    113
Bảng 4.7. Hiệu quả ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư tuyến tiền liệt của một số
dẫn xuất benzamid    117
Bảng 4.8. Tác dụng chống tăng sinh tế bào ung thư của tectochrysin    119 
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc tinh thể IL-8 monomer    4
Hình 1.2. Minh họa cấu trúc CXCR1/2 trong phức IL-8/CXCR1/2/protein G    5
Hình 1.3. Minh họa vị trí tương tác giữa IL-8 với thụ thể CXCR1 (8IC0) và CXCR2
(6LFO)    6
Hình 1.4.    Sự tương tác giữa IL-8 và kháng thể LY3041658    8
Hình 1.5.    Sự tương tác giữa CXCR2 và chất ức chế EBX    8
Hình 1.6.    Con đường dẫn truyền tín hiệu của IL-8/CXCR1/2    9
Hình 1.7.    Cơ sở docking bằng công cụ FlexX/ LeadIT    16
Hình 1.8.    Minh họa phương pháp đo lường sự gắn kết. (A) ITC    và    (B)    SPR    22
Hình 1.9.    Kit thử nghiệm gắn kết IL-8/CXCR1/2 của hãng RayBioTech®    25
Hình 1.10. Cấu trúc của MTT và sản phẩm có màu formazan    27
Hình 2.1.    Tóm tắt    sơ đồ nghiên cứu sàng    lọc dựa trên cấu trúc    34
Hình 2.2.    Minh họa giao diện PLIF trong    phần mềm MOE 2015.10    40
Hình 2.3. Cấu trúc các chất ức chế CXCR2 vị trí allosteric    41
Hình 2.4.    Tóm tắt    các bước tiến hành mô    phỏng động lực học phân    tử    45
Hình 2.5.    Tóm tắt    các bước tiến hành thử    nghiệm ức chế tương tác    49
Hình 2.6. Tóm tắt thử nghiệm đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư do
IL-8    cám ứng    52
Hình 3.1.    Mô    hình PhIL8-CXCR1    (A)    và    PhCXCR1-IL8 (B)    54
Hình 3.2.    Mô    hình PhIL8-CXCR2    (A)    và    PhCXCR2-IL-8 (B)    55
Hình 3.3.    Mô    hình PhIL8-LY3041658-S1    (A) và PhIL8-LY3041658-S2 (B)    56
Hình 3.4. Mô hình docking phân tử (vùng màu xanh): (A) D-IL8-CXCR1/2 và
(B) D-IL8-LY3041658    57
Hình 3.5. Mô hình docking phân tử (vùng màu xanh): (A) D-CXCR1-IL8 và
(B) D-CXCR2-IL8    57
Hình 3.6. Tỷ lệ chất dock thành công qua các mô hình gắn kết docking phân tử    59
Hình 3.7. Sự phân bố chất dock thành công theo khoảng điểm số docking    60
Hình 3.8. Sự tương tác của 4 chất tiềm năng trên khoang D-IL8-CXCR1    61
Hình 3.9. Sự tương tác của 11 chất tiềm năng trên khoang D-IL8-CXCR2    61
Hình 3.10. Sự tương tác của 4 chất tiềm năng trên khoang D-IL8-LY3041658    62
Hình 3.11. Phân tích PLIF các chất trong khoang gắn kết của IL-8 với CXCR1 (A),
CXCR2 (B) và kháng thể LY3041658 (C)    62
Hình 3.12. Phân tích PLIF các chất trong khoang gắn kết của CXCR1/2    63
Hình 3.13. Sự tương tác của 19 chất tiềm năng trên khoang D-CXCR1-IL8    64
Hình 3.14. RMSD của 19 phức hợp tiềm năng    67
Hình 3.15. RMSF của protein tự do/phức hợp của các chất tiềm năng    68
Hình 3.16. Tỷ lệ liên kết hydro của các chất thuộc ngân hàng thuốc (DB) với acid amin
của CXCR2 trong quá trình MDs 100ns    69
Hình 3.17. Tỷ lệ liên kết hydro của các chất thuộc thư viện ZINC (A), HCPLNB (B)
và CCVKN (C) với acid amin của CXCR2 trong quá trình MDs 100ns    70
Hình 3.18.    Năng lượng gắn kết tự do    của 19    chất    trong phức    hợp với CXCR2    71
Hình 3.19.    Biểu đồ “BOILED-Egg” của    các    chất    phân tích    72
Hình 3.20.    Mô hình A    73
Hình 3.21.    Mô hình PhCXCR2-EBX    và    sự gióng    hàng lên CXCR2    75
Hình 3.22. Mô hình gắn kết docking phân tử D-CXCR2-EBX (A) và 10 cấu dạng redocking của    EBX trong khoang gắn CXCR2 (B)    75
Hình 3.23.    Kết quả    gắn kết docking phân tử qua mô hình D-CXCR2-EBX    76
Hình 3.24.    Kết quả    MDs của phức CXCR2/ZINC77105530    78
Hình 3.25.    Kết quả    MDs của phức CXCR2/ZINC93176465    79
Hình 3.26. Năng lượng gắn kết tự do của phức hợp CXCR2 và ZINC77105530,
ZINC93176465, EBX    79
Hình 3.27. Tóm tắt kết quả nghiên cứu sàng lọc in silico    81
Hình 3.28. Hiệu quả ức chế tương tác IL-8/CXCR2 của ba chất tiềm năng theo
nồng độ    83
Hình 3.29. Sự tăng sinh các dòng tế bào ung thư được cám ứng bởi IL-8    84
Hình 3.30. Tác động của IL-8 100 ng/mLvà/hoặc các chất thử nghiệm tại nồng độ
100 pM lên sự sống sót tế bào LNCaP    85
Hình 3.31. Tỷ lệ tế bào sống do tác động IL-8 và 6 chất thử nghiệm theo nồng độ    86
Hình 3.32. Tỷ lệ tế bào sống do tác động của 6 chất thử nghiệm theo nồng độ    87
Hình 4.1. RMSD của các phức hợp CXCR2 với DB07754, ZINC1251190, acid usnic và cefixim    97
Hình 4.2. Minh họa vị trí các phối tử trong khoang gắn kết CXCR2 ở thời điểm 0 ns(xanh lá), 50 ns (cam) và 100 ns (xanh dương). (A) DB07754, (B) ZINC1251190,
(C) acid usnic và (D) cefixim    97
Hình 4.3. Các nhóm cấu trúc của 6 hợp chất tiềm năng tham gia tương tác với acid
amin quan trọng của CXCR2 trong quá trình MDs    100
Hình 4.4. Sự tương tác của bốn phối tử đại diện cho 4 thư viện chất tại khoang gắn kết
CXCR2 trong quá trình gắn kết docking phân tử (A) và MDs 100 ns (B)    101
Hình 4.5. Nhóm cấu trúc có khả năng gây độc tính (in đậm) của ZINC0220077 và
DB15327    104
Hình 4.6. (A) Tương tác giữa CXCR2 và EBX1. (B) Sự gióng hàng EBX1 (xanh lá),
ZINC77105530 (cam) và ZINC93176465 (xanh dương) lên mô hình pharmacophore PhCXCR2-EBX    106
Hình 4.7. Cấu trúc 2D của ZINC77105530 (A1), ZINC93176465 (A2) và sự hình
thành tương tác của hai phối tử trong docking phân tử (B1,B2) và MDs (C1,C2)
    108
Hình 4.8. Năng lượng gắn kết mỗi acid amin của CXCR2 với hai chất tiềm năng ….109
Hình 4.9. Minh họa vị trí của ba chất tiềm năng và ELR motif của IL-8 trong khoang
CXCR2 từ kết quả docking phân tử    110

Nguồn: https://luanvanyhoc.com

Leave a Comment