Sàng lọc đột biến mất đoạn gen dystrophin ở 30 bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne(Duchenne Muscular dystrophy(DMD)) là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X và phổ biến nhất trong các bệnh cơ di truyền, tần số 1/3500 trẻ trai .
Tiên lượng của bệnh nặng, có thể dẫn đến tàn phế, mất khả năng đi lại và chết trước tuổi trưởng thành. [5]. Nguyên nhân của bệnh DMD là do đột biến gen dystrophin dẫn tới không tổng hợp được dystrophin (protein này tham gia vào cấu

trúc và chức năng bảo vệ màng tế bào cơ), vì vậy ở những bệnh nhân DMD sự vắng mặt dystrophin ở màng tế bào cơ làm tế bào cơ bị hủy hoại khi co cơ → giải phóng enzyme đặc hiệu của cơ là creatine kinase (CK) vào máu và biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của trẻ[5].
Bệnh DMD phát sinh do 2 cơ chế di truyền hoặc đột biến mới, vì vậy bệnh liên tục xẩy ra ở Việt Nam cũng như các nước trên thế giới. Đối với  bệnh di  truyền tiên  lượng nặng như  bệnh DMD xu hướng chung của thế giới là phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân, phát hiện những người nữ lành mang gen bệnh, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh nhằm mục đích phòng ngừa sinh con bị bệnh DMD.
Gen dystrophin nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể X (Xp2.1), chiều dài 2400 Kb, chứa 79 exon, với ít nhất 8 promoter đặc hiệu mô và là gen lớn nhất của người. Nhiều nước trên thế giới đã nghiên cứu đột biến gen gây bệnh DMD cho thấy đột biến gen có thể rải rác khắp 79 exon và vùng promoter của gen. Các dạng đột biến gen: chủ yếu là mất đoạn là chiếm tỷ lệ từ 55 – 65%, còn lại là các đột biến điểm, nhân đoạn, thêm đoạn,  chuyển  đoạn.  Đột  biến  mất  đoạn  gen chiếm tỷ lệ cao nhất trong các loại đột biến gen dystrophin và thường tập trung vào 2 vùng “hot spots” là vùng dễ xẩy ra các đột biến mất đoạn, vùng 1 từ exon 1 – 19; vùng 2 từ exon 43 – 60 [9]. Vì vậy các tác giả thường sử dụng 18 – 25 cặp mồi để tăng lượng 18 – 25 exon trong vùng hay xẩy ra mất đoạn gen, có khả năng phát hiện 98% đột biến mất đoạn gen [3] [2].
Ở  nước  ta,  việc  sàng  lọc  phát  hiện  nhanh bệnh DMD chủ yếu dựa trên các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm đo hoạt độ enzyme creatine kinase (CK), xét nghiệm điện cơ và dựa trên tiền sử gia đình, phát hiện nữ dị hợp tử mang gen bệnh cũng được sàng lọc bước đầu bằng xét nghiệm CK, tuy nhiên phương pháp này không thể phát hiện đột biến gen và chẩn đoán trước
sinh [6]. Ở nước ta hiện nay đang quan tâm áp dụng các phương pháp di truyền phân tử để phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân và tiến tới chẩn đoán trước sinh cho những gia đình với đột biến đã biết. Trong các dạng đột biến gen dystrophin thì đột biến mất đoạn gen thường gặp nhất. Vì vậy chúng tôi ưu tiên áp dụng kỹ thuật multiplex PCR để phát hiện đột biến mất đoạn gen là loại đột biến chiếm tỷ lệ cao. Từ thực tế trên, nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu:
1.    Xác định đột biến mất đoạn một số exon của gen dystrophin ở những bệnh  nhân  DMD bằng kỹ thuật Multiplex PCR.
2.    Bước đầu tìm hiểu xem exon nào của gen dystrophin thường xẩy ra mất đoạn.
I.    ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG    PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Đối tượng nghiên cứu
30 bệnh nhân DMD được chẩn đoán xác định là DMD tại khoa Nội tiết – Chuyển hoá – Di truyền Bệnh viện Nhi Trung ương từ tháng 6 năm 2005 đến tháng 7 năm 2006, dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng như Duchenne và Gowers mô tả và xét nghiệm enzyme CK (tăng từ 20 –100 lần hoặc hơn nữa so với trị số bình thường), xét nghiệm điện cơ. Mỗi bệnh nhân được làm bệnh án và hỏi về tiền sử gia đình và xây dựng gia hệ: Các gia đình có tiền sử di truyền (TSDT) rõ là các gia đình có 2 con bị bệnh hoặc 2 thế hệ có người bị bệnh, các gia đình có TSDT không rõ là các gia đình chỉ sinh duy nhất 1 con bị bệnh DMD.
2.    Phương pháp nghiên cứu
–    Mỗi bệnh nhân được lấy 1 ml máu có chống đông EDTA. ADN tổng số của bệnh nhân được chiết tách từ máu theo bộ kit chiết tách ADN của Qiagen. ADN sau khi tách được dùng để thực hiện phản ứng Multiplex PCR với 25 cặp mồi  được thiết kế theo Chamberlain và cộng sự, Beggs và cộng sự [3] [2].
–    Kỹ thuật Multiplex PCR với 25 cặp mồi để tăng lượng 25 exon thường xẩy ra mất đoạn  được  chia làm 3 tổ hợp phản ứng: tổ hợp A  tăng  lượng các exon 4, 8, 12, 17, 19, 44, 45, 48, 51; tổ hợp B tăng lượng các exon 3, 6, 13, 43, 47, 50, 52, 60 và vùng promoter cơ (Pm); tổ hợp C tăng lượng các exon 16, 32,34, 41, 42, 49 và vùng promoter não (Pb).
–    Phản ứng PCR được thực hiện trong thể tích 25μl với các thành phần chính như sau:  Buffer taq,  dNTP,  MgCl2,  1,25  unit  Taq  DNA  poly- merase, 100ng ADN mẫu, primer mỗi loại, nước vừa đủ 25μl.
–    Phản ứng PCR được thực hiện theo  chương trình: khởi đầu là 950C /15 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ: 950C /30 giây, 530C/30 giây, 650C/40 giây và cuối cùng là 650C kéo dài 10 phút. Các tổ hợp khác thì nhiệt độ gắn mồi  thay đổi tuỳ từng tổ hợp. Sản phẩm PCR được  chạy điện di trên gel agarose 3% và nhuộm ethidium bromid 0,5 μg/ml. Mỗi phản ứng đều có đối chứng dương (ADN của người nam bình thường) và đối chứng âm (mẫu được thay bằng nước cất) kèm theo.
–    Đọc kết quả dưới đèn tử ngoại UV, kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu được đọc so với Marker thang chuẩn 100bp. Ở người nam bình thường trên hình ảnh điện di sẽ  xuất  hiện các băng đặc hiệu tương ứng với sản phẩm PCR của 25 exon. Ở bệnh nhân DMD đột biến mất đoạn exon nào sẽ không có băng đặc hiệu cho exon đó, vì khi bị đột biến mất đoạn ADN của exon đó sẽ không có vị trí bổ trợ để mồi gắn vào nên không có sản phẩm PCR của băng đó.
DMD là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X, được gây nên bởi đột biến gen dystrophin, đột biến mất đoạn gen là dạng phổ cập nhất và thường tập trung ở một số exon. Mục tiêu: Sàng lọc khuyết đoạn gen dystrophin ở một số bệnh nhân DMD bằng phương pháp Multiplex PCR. Phương pháp: Phân tích ADN từ 30 bệnh nhân DMD. Trong nghiên cứu này, phương pháp Multiplex PCR với 25 cặp mồi được sử dụng để tăng lượng 23 exon và vùng promoter cơ và promoter não. Những mất đoạn exon được phát hiện bằng điện di sản phẩm PCR. Kết quả: Chúng tôi đã phát hiện đột biến mất đoạn gen ở 11 bệnh nhân trong tổng số 30 bệnh nhân nghiên cứu (36,7%). Phân bố những mất đoạn exon tập trung ở 2 vùng hay xẩy ra mất đoạn: Vùng từ exon 45 – 52 là chủ yếu (87,9%); vùng tận cùng 5 hiếm gặp hơn (12,1%). Kết luận: Phương pháp PCR nên được áp dụng để sàng lọc những đột biến mất đoạn gen ở bệnh nhân DMD để tư vấn di truyền, phòng ngừa sự ra đời của những trẻ nam bị bệnh DMD.