Sàng lọc khuyết đoạn gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne trên tế bào ối thai phụ có nguy cơ cao

 

 Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy – DMD) là bệnh cơ di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể (NST) X phổ biến nhất, tần số 1/3500 trẻ trai. DMD là bệnh khó có khả năng chữa trị, điều trị gen rất tốn kém và còn gặp nhiều khó khăn lớn, tiên lượng của bệnh nặng có thể dẫn đến tàn phế và chết trước tuổi trưởng thành. Bệnh bị gây nên do đột biến gen dystrophin, gen này nằm trên nhánh ngắn của NST X, vị trí (Xp21.1), với kích thước 3000 Kb, chứa 79 exon và ít nhất 7 promoter đặc hiệu mô, gen tổng hợp ra dystrophin, protein này tham gia vào chức năng cấu trúc và bảo vệ màng tế bào cơ [8]. Vị trí (locus) gen dystrophin rất không vững bền: 1/3 những trường hợp DMD do đột biến mới không có tiền sử di truyền, 2/3 do nguyên nhân di truyền. Khoảng 50 – 70% những trường hợp DMD gây nên là do đột biến mất đoạn lớn, 6% là do nhân đoạn. Cả hai những mất đoạn lớn và nhân đoạn được tập trung thành đám ở 2 vùng: vùng tận cùng 5 từ exon 1–19, vùng trung tâm của gen từ exon 43 – 60 [1, 2]. Những trường hợp còn lại là do đột biến điểm hoặc do những đột biến mất đoạn hoặc nhân đoạn nhỏ, thường trải dài dọc theo toàn bộ gen [8].

Đối với những bệnh di truyền tiên lượng nặng này, hiện nay xu hướng chung của thế giới là phòng bệnh bằng cách áp dụng những tiến bộ kỹ thuật ADN để phát hiện đột biến gen ở người bệnh, phát hiện những người nữ lành mang gen bệnh, tư vấn di truyền cho gia đình thực hiện hạn chế sinh đẻ hoặc chẩn đoán trước sinh để tránh sinh ra những trẻ trai bị bệnh DMD [8].

Có rất nhiều phương pháp để phát hiện đột biến gen, mỗi phương pháp tương ứng với từng loại đột biến, phương pháp PCR rất ích lợi để phát   hiện   những   tổn   thương  lớn   của   gen dystrophin ở nam bị bệnh, nhưng phương pháp này không cung cấp thông tin về tình trạng người mang gen (carriers) ở những người phụ nữ liên quan đến bệnh nhân. Những loại đột biến khác và tình trạng người nữ mang gen (carriers) được phát  hiện  bằng  nhiều  phương  pháp  di  truyền phân tử khác [3, 4, 6, 8].

Ở nước ta hiện nay, số bệnh nhân được chẩn đoán là DMD ngày càng nhiều, chủ yếu dựa trên các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm đo hoạt độ enzyme creatine kinase (CK), điện cơ và tiền sử gia đình và phát hiện đột biến mất đoạn gen. Vì vậy số những người nữ trong gia đình liên quan với bệnh nhân DMD theo dòng họ mẹ như: mẹ bệnh nhân, chị em gái của mẹ bệnh nhân muốn sinh con tiếp theo hoặc chị em gái của bệnh nhân lớn lên xây dựng gia đình muốn sinh con. Đó là những phụ nữ có nguy cơ cao, có nhu cầu cấp thiết được tư vấn di truyền và áp dụng sàng lọc trước sinh để phòng tránh sinh ra trẻ bị bệnh DMD.

Trong điều kiện hiện nay nước ta mới bước đầu áp dụng kỹ thuật multiplex PCR để phát hiện đột biến mất đoạn gen gây bệnh DMD và xác định giới của thai. Vậy làm thế nào để góp phần hạn chế sự ra đời của những trẻ bị bệnh DMD. Từ thực tế trên, đề tài này thực hiện nhằm mục tiêu:

Ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR sàng lọc trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne trên tế bào ối.

I. ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu

– 5 thai phụ có tiền sử sinh con bị bệnh DMD: 4 thai phụ được theo dõi và chọc ối từ tuần thai thứ 13 – 16, 1 thai phụ được theo dõi và chọc ối từ tuần thai thứ 18. Các con trai của các thai phụ bị bệnh DMD cũng được lấy máu  để phát hiện đột biến mất đoạn gen làm đối chứng bệnh.

– Có một thai phụ từ thành phố Hồ Chí Minh (chọc ối hơi muộn ở tuần thai thứ 24), bệnh nhân nam DMD con của thai phụ cũng  được lấy 2 ml máu để xét nghiệm ADN phát hiện mất đoạn gen.

2. Phương pháp nghiên cứu

– Phương pháp chọc ối được thực hiện bởi các bác sĩ Sản khoa tại khoa sản bệnh viện Bạch Mai và bệnh viện phụ sản Từ Dũ. Mỗi thai phụ được lấy 8 ml dịch ối.

– Chiết tách ADN từ tế bào ối và máu  của bệnh nhân DMD theo phương pháp  Qiagen kit. Các mẫu ADN chiết tách được  đo  OD260 nm  để tính nồng độ ADN và đo tỉ số OD260 nm/ OD280 nm để kiểm tra độ tinh sạch của ADN.

– Các mẫu ADN được dùng sàng lọc bước 1 để xác định giới tính của thai (thai nam mới áp dụng kỹ thuật Multiplex PCR để phát hiện đột biến mất đoạn hoặc không). Chẩn đoán xác định giới tính của thai bằng phương pháp multiplex PCR với 2 cặp mồi: Cặp mồi DQ để tăng lượng một đoạn ADN  kích  thước  239/242  cặp  bazơ  (bp)  trên nhiễm sắc thể số 6 có mặt ở cả người nam và nữ, cặp mồi gen để tăng lượng vùng gen SRY (Sex determining region Y gene) kích thước 139 bp có gen TDF biệt hoá tinh hoàn (testis determining factor ). Kết quả PCR được điện di trên gel agarose 1,5%  và  nhuộm  gel  bằng  Ethidium  bromide 0,5 mg/ml, đọc dưới đèn cực tím: nếu là thai nam sẽ xuất hiện 2 băng đặc hiệu 139 bp cho gen biệt hoá tinh hoàn (TDF) và băng 239/242 bp cho HLA – DQa. Nếu là thai nữ sẽ chỉ xuất hiện băng 239/242 bp đặc hiệu cho HLA – DQ∝ ở người.

– Những mẫu ADN chiết tách từ tế bào  máu của các bệnh nhân DMD và tế bào ối của  thai, nếu là thai nam, sẽ được thực hiện  phản ứng Multiplex PCR với 25 cặp mồi của gen dystrophin: chia làm 3 tổ hợp phản ứng: phản ứng Multiplex PCR (tổ hợp A) với 9 cặp  mồi để tăng lượng 9 exon của gen dystrophin 45, 48, 19, 17, 51, 8, 12, 44, 4; phản ứng  Multiplex PCR (tổ hợp B) với 9 cặp mồi để tăng lượng vùng promoter cơ (Pm) và 8 exon  tương ứng của gen dystrophin 3, 43, 50, 13, 6, 47, 60, 52; phản ứng Multiplex PCR (tổ hợp C) với 7 cặp mồi để tăng lượng vùng promoter não

(Pb) và 6 exon 49, 42, 41, 34, 32, 16. Các kỹ thuật trên được tiến hành tại bộ môn Y sinh học – Di truyền – Trường Đại học Y Hà Nội và phòng Di truyền Phân tử bệnh viện Nhi Trung ương. – 25 cặp mồi được thiết kế theo Chamberlain và Beggs năm 1990.

– Phản  ứng  Multiplex  PCR  được  thực  hiện trong thể tích 25 µl với các thành phần chính như sau: Buffer taq, dNTP, MgCl2, 1,25  unit Hot star Taq DNA polymerase, 100ng  ADN mẫu, primer mỗi loại, nước vừa đủ 25µl.

– Chương trình PCR: khởi đầu là 950C/ 15 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ: 950C/ 30 giây,  530C/30 giây, 650C/ 40 giây và cuối cùng là 650C kéo dài 10 phút. Các tổ hợp khác thì  nhiệt độ gắn mồi thay đổi tuỳ từng tổ hợp.  Sản phẩm PCR được chạy  điện  di  trên  gel  agarose  3%  và  nhuộm ethidium bromid 0,5 mg/ml. Mỗi phản ứng đều có đối  chứng  dương  (ADN  của  người  nam  bình thường) và đối  chứng âm (mẫu được thay bằng nước cất) kèm theo.

– Đọc kết quả dưới đèn tử ngoại UV, kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu được  chụp ảnh và đọc so với Marker thang chuẩn 100bp. Ở thai nam bình thường trên hình ảnh  điện di sẽ xuất hiện các băng đặc hiệu tương  ứng với sản phẩm PCR của 23 exon và 2  vùng  promoter cơ (Pm), promoter não (Pb). Ở bệnh nhân DMD hoặc thai nam đột biến mất đoạn exon nào sẽ không có băng đặc hiệu cho exon đó.

– Thu  thập  các  thông  tin  và  kết  quả  xét nghiệm để tư vấn cho gia đình bệnh nhân về tình trạng của thai DMD là bệnh có tiên lượng nặng, di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X, bị gây nên bởi đột biến gen dystrophin. Thật cần thiết để phòng tránh sự ra đời của những trẻ nam bị bệnh DMD. Mục tiêu: nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR sàng lọc trước sinh bệnh DMD. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: thu thập tế bào dịch ối từ những thai phụ có nguy cơ, chiết tách ADN từ tế bào ối. Bước 1: sàng lọc xác định giới bằng kỹ thuật PCR với 2 cặp mồi cho gen TDF và DQ; bước 2: phát hiện mất đoạn gen ở bệnh nhân DMD và thai nam bằng kỹ thuật Multiplex PCR với 25 cặp mồi. Kết quả: 6 phụ nữ có thai, lần trước đã sinh con bị bệnh DMD được thực hiện sàng lọc, 4 thai nữ được phát hiện với gen TDF (-); 2 thai nam được phát hiện với TDF (+); sàng lọc bước 2 cho 2 thai nam đã phát hiện 2 thai nam không có đột biến mất đoạn được so sánh với bệnh nhân DMD của 1 gia đình có mất đoạn exon 50, 51, 52; bệnh nhân của gia đình thứ 2 mất đoạn exon 12 – > 17; 2 thai nam được chẩn đoán là không bị bệnh DMD. Kết luận: phương pháp PCR cho xác định giới và đột biến mất đoạn là phương pháp chính xác và nhanh, rất ích lợi để góp phần phòng tránh sinh con trai bị bệnh DMD.