Sao chép gen Activation Induced cytidine Deaminase (aid) ở mô ung thư dạ dày

Ung thư dạ dày (UTDD) là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong các trường hợp tử vong do ung thư và là bệnh phổ biến đứng thứ hai sau ung thư phổi. Tỷ lệ mắc UTDD cao nhất ở Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc, tỷ lệ mắc thấp nhất ở Bắc Mỹ [2]. Theo báo cáo thường niên của Viện nghiên cứu ung thư Mỹ, năm 2007 Thế giới có thêm khoảng 12 triệu trường hợp ung thư mới và khoảng 7,6 triệu ca tử vong. Khu vực Đông và Đông Nam Á trong đó có Việt Nam, năm 2007 có 3,6 triệu trường hợp ung thư mới và khoảng 2,5 triệu trường hợp tử vong trong đó UTDD và ung thư tế bào gan nguyên phát là hai trong số ba nguyên nhân hàng đầu [1].

Trong  những  năm  gần  đây,  nhiều  phương pháp sinh học phân tử được ứng dụng để phát hiện sự thay đổi về gen trước khi xuất hiện sự thay đổi hình thái tế bào trong chẩn đoán ung thư. AID lần đầu tiên được phát hiện bởi nhóm nghiên cứu của Tasuku Honjo, trường Đại học Kyoto, Nhật Bản năm 1999 [3]. Phân tử AID bao gồm 198 acid amin với bốn vùng chức năng khác nhau và được mã hóa bởi gen AID nằm tại vị trí 12p13 trên nhiễm sắc thể số 12. Trong điều kiện sinh lý, sự biểu hiện của AID giới hạn tại tế bào lympho B hoạt hóa sinh kháng thể và được kiểm soát chặt chẽ bởi các yếu tố điều hòa [4]. Đối với tế bào không có thẩm quyền miễn dịch, sự tăng cường tổng hợp AID gây nên hiện tượng chuyển đoạn nhiễm sắc thể, tích lũy đột biến để khởi đầu cho quá trình ung thư hóa [7]. Với vai trò quyết định trong quá trình siêu đột biến, AID được coi như một tác nhân gây đột biến nội sinh khi quá trình kiểm soát sự biểu hiện AID bị mất cân bằng. Khi đó, dưới tác động của các yếu tố hoạt hóa, AID sẽ tác động trực tiếp lên các gen kháng ung thư, tích lũy đột biến, từng bước làm bất hoạt và mất chức năng kháng ung thư của các gen đó. Các nghiên cứu thực nghiệm trên tế bào biểu mô dạ dày nhiễm chủng H. Pylori cho thấy sự gia tăng biểu hiện AID ở mức độ mRNA [6,7]. Sự phát hiện này chứng tỏ AID hứa hẹn là một marker hữu hiệu trong chẩn đoán và tiên lượng ung thư. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu:

1. So sánh mức độ sao chép của AID ở mô viêm và mô ung thư dạ dày.

2. So sánh mức độ sao chép của AID của mô ung thư dạ dày nhiễm HP và không nhiễm HP.

II. ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu

2 mẫu mô viêm dạ dày, 2 mẫu mô lành cách vị trí khối viêm dạ dày 5 cm (của 2 bệnh nhân viêm dạ dày không có bệnh lý khác kèm theo). 15 mẫu mô ung thư dạ dày, 15 mẫu mô lành cách vị trí khối u 5cm (của 15 bệnh nhân ung thư dạ dày, không có bệnh lý ung thư khác kèm theo). Toàn bộ mẫu nghiên cứu đã được chẩn đoán mô bệnh học tại bệnh viện Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1 Tách chiết RNA tổng số: Mô bệnh phẩm (120 – 150 mg) được nghiền trong 1ml dung dịch isogen  tạo  thành  hỗn  dịch  đồng  nhất.  Dịch nghiền được chuyển sang ống eppendorf, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Thêm 0,2 ml chloro- form, lắc nhẹ 15 giây, để ở nhiệt độ phòng trong

2 – 3 phút, ly tâm 15.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, hút phần dịch nổi trên cùng chứa RNA. Bổ sung 0,5 ml isopropanol, lắc nhẹ, để  ở nhiệt độ phòng trong 5 – 10 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C. Giữ lại phần cặn ở đáy ống sau đó rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu hồi tủa và hòa tan tủa bằng 20 µl nước cất có diethyl pyrocarbonate (DEPC).

2.2 Tổng hợp cDNA: RNA tách chiết được đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Nano- Drop1000 ở bước sóng 260 nm. RNA được dùng tổng hợp cDNA với sự tham gia của enzym phiên mã ngược MMLV – RT, 10 pmol mồi ngẫu nhiên (random primer), dNTPs, chất ức chế protein DTT 0,1M và chất ức chế phân hủy RNA (RNA ase out). cDNA pha loãng bằng nước cất có diethyl pyrocarbonate (DEPC) đạt nồng độ 400 ng/µl.

Phản ứng Realtime PCR khuếch đại gen mã hóa AID và  actin ở mô dạ dày: Phân tích sự biểu hiện AID và  actin ở mô dạ dày bằng phản ứng realtime PCR sử  dụng  primer và probe đặc hiệu cho mỗi  gen. Gen  actin được dùng làm tham chiếu. Thành phần phản ứng realtime PCR: được tiến hành với tổng thể tích 25µl  gồm:  1x master mix, 10 pmol mồi xuôi và mồi ngược, 10 pmol probe, 400 ng cDNA.  Chu trình phản ứng: 950C – 15 phút; [950C – 15 giây; 600C – 1 phút] x 40 chu kỳ.

Xác định HP bằng phương pháp Clotest

Xử lý số liệu: Xử lý số liệu theo SPSS 16.0