So sánh trình tự Nucleotide ở vùng e và c/pre-m của chủng virut viêm não Nhật Bản lưu hành ở miền bắc Việt Nam với chủng Sa-14

Viêm não Nhật Bản Thuộc nhóm Arbovirus, có vật  liệu  di  truyền là  ARN  sợi âm. Lợn, chim  là những ổ chứa virút và muỗi Culex  là vectơ truyền virút từ các ổ chứa sang người. Muỗi Culex tri- taeniorhynchus đóng vai trò chính trong việc truyền bệnh và đồng thời là ổ chứa trong tự nhiên [1, 2, 3, 4, 5]. Để tìm hiểu sự thay đổi về vật liệu di truyền của chủng virut lưu hành tại miền Bắc Việt Nam so với các chủng virut phân lập từ trước đó, phục vụ cho chiến lược sử dụng vacxin phòng bệnh ở nước ta chúng tôi tiến hành đề tài với mục tiêu:

So sánh một phần cấu trúc gen của virút VNNB chủng HNH693 đang lưu hành ở miền Bắc Việt Nam với chủng virút VNNB hoang dại SA-14.

II. ĐỐI  TƯỢNG VÀ  PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng

– Chủng HNH693 dạng đông khô do phòng thí nghiệm Viêm não, khoa vi rút, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương cung cấp.

– Trình tự nucleotide của chủng SA14 phân lập từ muỗi ở Bắc Kinh năm 1954 được cung cấp bởi ngân hàng gen (gen bank), [7].

– Oligonucleotide mồi:

Đoạn mồi xuôi:

VNNB 390: 5′-GGCAGAAAGCAAAACAAAAG-3′ VNNB 1837: 5′-GTAGGCTGAAAATGGACAAA-3′

Đoạn mồi ngược:

VNNB 736: 5′-GGATCTCCTGCTTCGCTTGG-3′ VNNB 2306: 5′-TGAAGGCACCACCAAACACT-3′

2. Phương pháp

Tách triết ARN của virut VNNB bằng phenol và chloroform.

Tổng hợp cADN  bổ trợ: 24µl ARN virut; 1µl dP (N6);    10µl  PBS  x  5;  dNTP  1µl;  RNAsin  0,2µl enzym phiên mã ngược 0,5µl; nước cất 2 lần 13,3µl. Sau đó ủ 42oC trong nồi cách thủy trong 1 giờ. Sản phẩm thu được là ADN bổ trợ được bảo quản ở  -80oC cho đến khi thử nghiệm.

Phản ứng chuỗi polymerase

Cho  lần  lượt  vào  tube  eppendoff  các  thành phần theo thứ tự 1µl ADN bổ trợ của virút VNNB; 2,5µl PBS x 10 lần; 2,5µl dNTP (2mM); 1µl mồi xuôi; 1µl mồi ngược; 0,2µl Tag-polymerase; 16,8µl nước cất 2 lần vô trùng, 1 giọt dầu parafin, ly tâm nhanh 30 giây.

Đặt vào máy khuếch đại PCR và đặt chương trình 94oC/1 phút

55 – 56oC/1 phút 45 chu kỳ

72oC/4 phút

Tinh sạch ADN bằng bộ sinh phẩm  của hãng Boehringer Mannheim.

Tiến hành phân tích trình tự sắp xếp nucleotide từ sản phẩm thu được. Sử dụng phương pháp xác định trình tự nucleotide của Sanger. Kết quả cuối cùng được ghi lại bằng máy ghi tự động Fuji (Minamiashigara,

Kanagawa, Nhật Bản) X-film. Phân tích trình tự nucleotide và acid amin bằng máy tính, chương trình GENAS. Các kỹ thuật này được thực hiện ở Trung tâm nghiên cứu sinh học phân tử của trường Đại học Tổng hợp kỹ thuật Queenland, Úc.

Các  đoạn mồi: 390 và 736 có trình tự sắp xếp nucleotide tương ứng với điểm cuối 5′ nucleotide lai ghép của vùng  gen lõi và tiền màng (C/preM) của virút VNNB. Trên sơ đồ sau: