SỰ ĐỘT BIẾN KHÁNG RIFAMPICIN VÀ ISONIAZID CỦA MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG HUẾ

LUẬN ÁN SỰ ĐỘT BIẾN KHÁNG RIFAMPICIN VÀ ISONIAZID CỦA MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG HUẾ.Bệnh lao là một bệnh truyền nhiễm do Mycobacterium tuberculosis gây ra và đã từng được Tổ chức y tế thế giới (WHO) khuyến cáo về tình trạng khẩn cấp toàn cầu vì tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ tử vong cao, di chứng và hậu quả nặng nề về mặt kinh tế và xã hội kèm theo. Bệnh lao gia tăng cùng với đại dịch HIV/AIDS và tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao đang là một vấn đề đáng lo ngại. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ghi nhận có khoảng 9 triệu người bị mắc bệnh lao mới trong năm 2013, hơn một nửa (56%) là ở Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương, có 1,5 triệu ca tử vong do bệnh lao, trong đó 360.000 người có HIV dương tính (WHO-2014) [128].

Vi khuẩn lao được phân lập vào năm 1882 và Streptomycin là thuốc kháng lao đầu tiên được tìm ra bởi Selman Abraham Waksman năm 1944 nhưng cho đến nay bệnh lao vẫn là một trong những bệnh gây chết người nhiều nhất hằng năm tại các nước đang phát triển [99], [109]. Từ những thập niên 90 đến nay, đã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn lao kháng thuốc, rất khó điều trị và đang có nguy cơ lây lan rất nhanh, đe dọa hàng triệu người trên thế giới. Theo WHO, năm 2013 đã có 480.000 ca bệnh lao đa kháng thuốc (Multidrug-resistant TB, MDR-TB) và trong số đó, 210.000 người đã tử vong [128]. Tỷ lệ lao đa kháng thuốc trong tổng số ca nhiễm lao mới toàn cầu là 3,5% và trong tổng số ca đã qua điều trị là 20,5%. Tỷ lệ tử vong do bệnh lao là 15/100.000 dân.

Việt Nam đứng thứ 12 trên 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu. Năm 2013, Việt Nam ước tính có 130.000 ca nhiễm lao mới và tương đương tỷ lệ mắc bệnh là 144 ca/100.000 dân. Tỷ lệ lao đa kháng thuốc trong tổng số ca nhiễm lao mới là 4% và trong tổng số ca đã qua điều trị là 23% [128].

Vấn đề vi khuẩn lao kháng thuốc là một nội dung cần quan tâm rất lớn trong các chương trình kiểm soát bệnh lao. Vi khuẩn lao đa kháng thuốc, được định nghĩa là kháng ít nhất hai loại thuốc Rifampicin (RIF) và Isoniazid (INH), ngày càng gia tăng. Hơn nữa, WHO cũng đã đưa ra khái niệm vi khuẩn lao kháng thuốc rộng rãi hay cực kháng (Extensive Drug Resistance TB, XDR-TB), là những vi khuẩn lao đã kháng lại RIF, INH, đồng thời kháng thêm với bất cứ loại nào trong nhóm Quinolon và kháng ít nhất một loại thuốc kháng lao hàng thứ hai dạng tiêm như Kanamycin, Amikacin. Năm 2013 đã có 100 quốc gia ghi nhận các trường hợp cực kháng và ước tính có khoảng 9% trường hợp XDR-TB trong số các bệnh nhân có MDR-TB [5], [35], [75], [128],Sự đột biến kháng Rifampicin và Isoniazid của Mycobacterium tuberculosis phân lập tại Bệnh viện Trung ương Huế

Rifampicin được bắt đầu sử dụng từ những năm 1960, đã có hiệu quả rất lớn trong điều trị bệnh lao. Do tác động diệt khuẩn cao nên RIF cùng với INH tạo thành một nhóm chính trong các thuốc điều trị lao dòng thứ nhất. Sự đề kháng RIF ngày càng tăng là do việc sử dụng rộng rãi loại thuốc này và do chọn lọc những đột biến đề kháng thuốc của vi khuẩn. Vì vậy, những đột biến này được xem là một “dấu hiệu” hiệu quả trong việc phát hiện nhanh những chủng lao đa kháng thuốc (MDR- TB). Đặc điểm chính để phát hiện kháng thuốc RIF là sự đột biến trên đoạn gen rpoB trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao. Bằng phát hiện kháng RIF cũng có thể xác định được tính kháng đa thuốc bởi vì các chủng kháng RIF phần lớn là đa kháng thuốc. Đối với INH, sự kháng thuốc thường được gây ra bởi đa dạng đột biến trong 4 gen (katG, inhA, kasA và ahpC), trong đó phần lớn (60-70%) các đột biến nằm trên gen katG [49], [88], [103],

Khả năng điều trị lao thành công có thể đạt 95 – 100 % đối với những bệnh nhân mắc lao thông thường, trong khi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng thuốc là 20 – 30 %, thậm chí còn không điều trị được khi mắc lao siêu kháng thuốc và kháng thuốc toàn bộ mặc dù đã dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị lao. Vì vậy, việc phát hiện nhanh và ngăn chặn sự lan truyền các chủng lao đa kháng thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong điều trị lao hiện nay [73], [87],

Sự đột biến kháng Rifampicin và Isoniazid của Mycobacterium tuberculosis phân lập tại Bệnh viện Trung ương Huế Từ trước đến nay, việc phát hiện và chẩn đoán lao nói chung cũng như lao kháng thuốc nói riêng đều dựa vào kỹ thuật soi trực tiếp, nuôi cấy và làm kháng sinh đồ. Nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường Lowenstein Jensen được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán nhưng lại mất nhiều thời gian (4 – 8 tuần). Trên hệ thống nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC cũng mất 2 tuần, nếu làm kháng sinh đồ lao mất thêm ít nhất 2 tuần nữa, do vậy khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh toán bệnh lao. Các kỹ thuật sinh học phân tử, trong đó có kỹ thuật giải trình tự đã khắc phục được những nhược điểm trên, nó cho phép chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc trong vòng 1-2 ngày. Giải trình tự gen là phương pháp cơ bản, xác định vi khuẩn lao đa kháng thuốc trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng chính xác và rõ ràng nhất [17], [21], [22], [23].

Ngày nay đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới nghiên cứu về lĩnh vực này và đã có nhiều kết quả có giá trị. Việc tìm hiểu để có thể áp dụng, phát triển được những kỹ thuật này ở Huế, nhất là kỹ thuật giải trình tự (sequencing) sẽ giúp xác định nhanh và chính xác vi khuẩn lao kháng RIF và INH, đồng thời xác định được đặc điểm đột biến kháng RIF và INH của các chủng M. tuberculosis phân lập được tại Huế, từ đó tiếp tục phát triển các nghiên cứu xa hơn.

Qua những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Sự đột biến kháng Rifampicin và Isoniazid của Mycobacterium tuberculosis phân lập tại Bệnh viện Trung ương Huế” để thực hiện các mục tiêu cụ thể sau đây:

1. Xác định tỷ lệ đề kháng các thuốc kháng lao dòng thứ nhất (Rifampicin, Isoniazid, Streptomycin và Ethambutol) của các chủng M. tuberculosis phân lập được tại Bệnh viện Trung ương Huế bẳng phương pháp nuôi cấy và kháng sinh đồ kinh điển.

2. Xác định đột biến trên gen rpoB và katG từ những chủng M. tuberculosis kháng Rifampicin và Isoniazid bằng phương pháp giải trình tự.

3. So sánh mức độ kháng thuốc theo tiền sử dùng thuốc kháng lao, vùng cư trú, nhóm tuổi, kết quả nhuộm Ziehl-Neelsen, giới, lao nhiễm và không nhiễm HIV.

DANH MỤC

CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BÓ

1. Bùi Đức Phú, Nguyễn Thị Nam Liên, Mai Văn Tuấn, Châu Thị Mỹ Dung và cộng sự (2014), “Nghiên cứu áp dụng bộ Kit MTB-PCR để chẩn đoán lao tại Bệnh viện TW Huế”, Tạp chỉ Y học lâm sàng – Bệnh viện Trung ương Huế, ISSN: 1859-3895, Số 20, tr. 57-61.

2. Bùi Đức Phú, Mai Văn Tuấn, Nguyễn Thị Nam Liên, Nguyễn Đặng Long

(2014), “Khảo sát tỷ lệ phát hiện và mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập tại Bệnh viện TW Huế ”, Tạp chỉ Y học lâm sàng – Bệnh viện Trung ương Huế, ISSN: 1859-3895, Số 20, tr. 62-68.

3. Mai Văn Tuấn, Phạm Hùng Vân, Hoàng Tiến Mỹ, Nguyễn Thị Nam Liên, Nguyễn Văn Hòa (2015), “Nghiên cứu đột biến gen katG và rpoB của vi khuẩn lao kháng thuốc Isoniazid và Rifampicin tại Bệnh viện TW Huế ”, Tạp chỉ Y học lâm sàng – Bệnh viện Trung ương Huế, ISSN: 1859-3895, Số 27, tr. 74-82.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A. Tiếng Việt

1. Lã Duy Anh (2009), Xác định các đột biến trên gen katG liên quan đến tỉnh kháng thuốc Isoniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ Y học chuyên ngành Di truyền, Đại học Thái Nguyên.

2. Nguyễn Văn Bắc (2010), Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử, Luận văn Thạc sỹ Y học chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

3. Bộ môn Lao, Đại học Y Dược Thái Nguyên (2009), Giáo trình Bệnh lao, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội.

4. Bộ môn Vi sinh, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh (2014), Giáo trình Vi khuẩn y học, tr.235-247.

5. Bộ Y Tế (2009), Tài liệu hướng dẫn chẩn đoán, điều trị và phòng lao, Hà Nội.

6. Bộ Y tế, Trung tâm truyền thông giáo dục sức khỏe trung ương (2005), Tình hình bệnh lao, Hà Nội.

7. Bộ Y tế (2011), Hướng dẫn quy trình triển khai kỹ thuật Gene Xpert.

8. Bộ y tế, Chương trình chống lao quốc gia (2012), Hướng dẫn quy trình thực hành chuẩn xét nghiệm vi khuẩn lao, Hà Nội.

9. Bộ Y tế, Bệnh viện Phổi Trung ương, Chương trình chống lao quốc gia (2014), “Thông cáo báo chí: Triển khai chiến lược quốc gia phòng, chố ng lao đến năm 2020 và tầm nhìn 2030”, Tạp chỉ Lao và Bệnh phổi, Số 16, tr. 5 – 9.

10. Bộ y tế, Chương trình chống lao quốc gia (2015), Báo cáo tổng kết hoạt động chống lao năm 2014 và phương hướng năm 2015, Hà Nội

11. Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.

12. Phạm Thọ Dược (2014), Thực trạng nhiễm HIV, bệnh lao AFB (+) và đánh giá hiệu quả can thiệp dự phòng ở nhóm nghiện chích ma túy tại tỉnh ĐăkLăk, Luận án Tiến sĩ y tế công cộng, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Hà Nội.

13. Phan Thượng Đạt (2008), “Kết quả điều trị lao phổi đa kháng thuốc bằng phác đồ với các thuốc kháng lao hàng thứ hai tại bệnh viện Phạm Ngọc Thạch”, Tạp chỉ Y học thành phố Hồ Chỉ Minh, tập 12 (3), tr. 149-152.

14. Nguyễn Huy Điện (2010), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng tràn dịch màng phổi do lao và tỉnh kháng thuốc của Mycobacterium tuberculosis ở bệnh nhân có xét nghiệm HIV (+), Luận án Tiến sĩ y học, Trường Đại học Y Hà Nội.

15. Lê Văn Đức, Lê Thị Minh Nguyệt, Đinh Ngọc Sỹ, Edine Tiemersma, Frank Cobelens (2013), “Tình hình dịch tễ lao/HIV tại thành phố Đà Nẵng 1999-2010”, Tạp chỉ Y học thực hành, Số 875, tr. 58-61.

16. Nguyễn Thu Hà, Trần Văn Sáng, Đinh Ngọc Sỹ (2011), “Tìm hiểu đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao phổi tái phát”, Tạp chỉ Y học thực hành, Số 8, tr. 76-78.

17. Nguyễn Thu Hà (2012), Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng, đột biến gen rpoB, katG và inhA của vi khuẩn trong lao phổi tái phát, Luận án tiến sĩ chuyên ngành Lao, Trường Đại học Y Hà Nội.

18. Nguyễn Duy Hưng, Nguyễn Thị Vân Anh, Phạm Kim Liên, Trần Thanh Hoa, Hồ Minh Lý (2009), “Đa dạng phân tử và mối liên quan với tính kháng thuốc của chủng lao M. tuberculosis phân lập ở Hưng Yên”, Tạp chỉ Nghiên cứuy học, Tập 65 (6), tr. 26-30.

19. Nguyễn Văn Hưng, Khiếu Thị Thúy Ngọc, Đinh Ngọc Sỹ, Nguyễn Thị Ngọc Lan, E.W. Tiemersma, F.G.J. Cobelens, D.van Soolingen (2011), “Sự phân bố của Mycobacterium tuberculosis kiểu gen Bắc Kinh và mối liên quan đến tính kháng thuốc lao tại Việt Nam”, Tạp chỉ Hô hấp Pháp-Việt, Tập 2 (2), tr. 61-65.

20. Dương Thị Loan, Trần Ngọc Dung, Nguyễn Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Ngọc Thủy (2012), “Tình hình lao phổi đề kháng thuốc tại thành phố Cần Thơ”, Tạp chỉ Y học thực hành, Số 6, tr. 42-44.

21. Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Văn Bắc, Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Thái Sơn (2009), “Chẩn đoán các chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin bằng phương pháp xác định đột biến trên gen rpoB”, Tạp chỉ Công nghệ sinh học, tập 7 (2), tr. 251-256.

22. Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Văn Bắc (2010), “Vi khuẩn lao kháng thuốc và các phương pháp phát hiện”, Tạp chỉ Công nghệ sinh học, tập 8

(2) , tr. 133-144.

23. Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Văn Bắc, Vũ Thị Mai, Cung Thị Ngọc Mai, Vũ Thị Thanh, Nguyễn Thái Sơn (2011), “Xác định các đột biến trên gen rpoB liên quan đến tính kháng Rifampicin của một số chủng vi khuẩn lao thu thập tại miền Bắc Việt Nam”, Tạp chỉ Khoa học và Công nghệ, tập 82 (6),

tr.’ 97-102.

24. Cao Minh Nga, Nguyễn Ngọc Lan, Cao Mỹ Hà (2005), “Tình trạng nhiễm HCV, HBV, HIV và lao trên các đối tượng nghiện ma túy”, Tạp chỉ Y học TP. Hồ Chỉ Minh, Số 9, Phụ bản số 1, tr. 73-78.

25. Lê Văn Nhi (2009), “Kháng thuốc lao và kết quả điều trị lao ở đối tượng nghiện chích ma túy mắc lao/HIV (+) bị nhiễm HTLV (+)”, Tạp chỉ Y học TP. Hồ Chí Minh, Số 13, Phụ bản số 6, tr. 391-403.

26. Trần Văn Sáng (2007), Bệnh học lao, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.

27. Nguyễn Thái Sơn, Lê Thu Hồng, Phùng Công Thường (2008), “Đặc điểm đột biến gen rpoB của một số chủng vi khuẩn lao kháng Rifampicin phân lập tại Việt Nam”, Tạp chỉ Nghiên cứu y học, số 1, tr. 44-49.

28. Đinh Ngọc Sỹ (2011), “Chiến lược quản lý bệnh lao đa kháng thuốc tại Việt Nam”, Journal of Franco-Vietnamese Association of Pulmonology, Tập 2

(3) , tr. 40-42.

29. Nguyễn Thị Thu Thái (2009), “Lao kháng đa thuốc và lao kháng đa thuốc mở rộng: thách thức, mối đe dọa và biện pháp trong kiểm soát”, Tạp chỉ Y học thực hành, Số 8 (670), tr. 57-59.

30. Nguyễn Thị Thu Thái, Nguyễn Thái Sơn (2012), “Tình hình kháng thuốc của các chủng vi khuẩn lao phân lập trên bệnh nhân lao phổi mới và lao phổi tái phát”, Tạp chỉ Khoa học và Công nghệ, tập 89 (01/2), tr. 105-109.

31. Nguyễn Thị Thu Thái, Nguyễn Thái Sơn, Đinh Ngọc Sỹ (2014), “Xác định đột biến katG trên chủng vi khuẩn lao kháng Isoniazid”, Tạp chỉ Y học dự phòng, tập 24, số 4 (153), tr. 17-21.

32. Hồ Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn Hưng, Lê Huyền Ái Thúy, Nguyễn Bảo Toàn (2009), “Phát hiện nhanh vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng các thuốc Isoniazid, Rifampin và Ethambutol bằng Multiplex Allele Specific PCR (MAS-PCR)”, Tài liệu báo cáo tại Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc năm 2009, Thái Nguyên.

33. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và giải trình tự. PCR và real-time PCR : Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

B. Tiếng Anh

34. Abdelaal Amina, Hassan Abd El-Ghaffar; Mohammad Hosam Eldeen Zaghloul et al. (2009), “Genotypic Detection of Rifampicin and Isoniazid Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains by DNA Sequencing: a Randomized Trial”, Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, Vol. 8, No. 4, pp. 1-8.

35. Anandi Martin, Françoise Portaels (2007), “Drug Resistance and Drug Resistance Detection”, TUBERCULOSIS 2007: From Basic Science to Patient Care. Chapter 19, www.TuberculosisTextbook.com

36. Anandi Martin, Panaiotov Stefan et al. (2008), “The nitrate reductase assay for the rapid detection of isoniazid and rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and meta-analysis”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Vol. 62, pp. 56-64.

37. Anandi Martin, Palomino Juan Carlos (2009), “Nitrate Reductase Assay (NRA) for Drug Susceptibility Testing for Mycobacterium tuberculosis”, Procedure Manual of Institute of Tropical Medicine, Mycobacteriology Unit, Antwerp, Belgium.

38. Ang C. F., C. S. Ong, A. Rukmana et al. (2008), “An overview of the phenotypic and genotypic characteristics of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from four Asian countries”, Journal of Medical Microbiology, Vol. 57, pp. 1039-1040.

39. Aslan Gonul, Tezcan Seda et al. (2008), “Genotypic Analysis of Isoniazid and Rifampin Resistance in Drug-Resistant Clinical Mycobacterium tuberculosis Complex Isolates in Southern Turkey”, Japanese journal of infectious diseases, Vol. 61, pp. 255-260.

40. Balasingham Seetha V., Tonje Davidsen, Irena Szpinda et al. (2009), “Molecular Diagnostics in Tuberculosis – Basis and Implications for Therapy”, Molecular diagnosis and therapy, Vol. 13, No. 3, pp. 137-151.

41. Bostanabad SZ., LP Titov, A Bahrmand, SA Nojoumi (2008), “Detection of mutation in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from tuberculosis patients in Belarus”, Indian Journal of Medical Microbiology, 26 (2), pp. 143-147.

42. Casali Nicola, Vladyslav Nikolayevskyy, Yanina Balabanova et al. (2014), “Evolution and transmission of drug resistant tuberculosis in a Russian population”, Nat Genet, Vol. 46 (3), pp. 279-286.

43. Caws M., Duy Phan M., Tho Dau Q. et al. (2006), “Mutations Prevalent among Rifampin- and Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Isolates from a Hospital in Vietnam”, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 44, No. 7, pp. 2333-2337.

44. Chandra-Yowani, S., Sukardika, I K., Mantik-Astawa, I N., and Junitha, I K. (2012), “Mutation in 1700 bp fragment of rpoB gene of multi-drug resistant

Mycobacterium tuberculosis isolate”, Indonesian Journal of Biomedical Sciences, Vol. 6, No. 2, pp. 43-46.

45. Chegou Novel N., Kim GP Hoek, Magdalena Kriel, Robin M Warren, Thomas C Victor, Gerhard Walzl (2011), “Tuberculosis Assays: Past, Present and Future”, Expert Review of Anti-Infective Therapy, Vol. 9 (4), pp. 457-469.

46. Cho Eun Hae, Bae Hye Kyung, Kang Seong Ki et al. (2009), “Detection of Isoniazid and Rifampicin Resistance by Sequencing of katG, inhA, and rpoB Genes in Korea”, Korean Journal of Laboratory Medicine, Vol. 29, pp. 455-60.

47. Da Silva Pedro Eduardo Almeida, Palomino Juan Carlos (2011), “Molecular basis and mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: classical and new drugs”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Vol. 66, pp. 1417-1430.

48. Dang Thi Minh Ha, Nguyen Thi Ngoc Lan, Marcel Wolbers, Tran Ngoc Duong et al. (2009), “Microscopic Observation Drug Susceptibility Assay (MODS) for Early Diagnosis of Tuberculosis in Children”, Public Library of Science (PloS) One, Vol. 4, Issue 12, pp. 1-10.

49. Deepa P., K. L. Therese and H. N. Madhavan (2005), “Detection and characterization of mutation in rifampicin resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates by DNA sequencing”, Indian Journal of Tuberculosis, Vol. 52, pp. 132-136.

50. Didi Bang, Âse Bengard Andersen, and Vibeke Ostergaard Thomsen (2006), “Rapid Genotypic Detection of Rifampin- and Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Directly in Clinical Specimens”, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 44, No. 7, pp. 2605-2608.

51. Duong Duy An, N. T. H. Duyen, N. T. N. Lan et al. (2009), “Beijing Genotype of Mycobacterium tuberculosis Is Significantly Associated with High-Level Fluoroquinolone Resistance in Vietnam”, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 53, No. 11, pp. 4835-4839.

52. Eldholm Vegard, Johana Monteserin, Adrien Rieux et al. (2014), “Four decades of transmission of a multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis outbreak strain”, Nature CommunicationsDOl: 10.1038/ncomms8119, pp. 1-9.

53. Elif Ozturk C., Ahmet Sanic, Demet Kaya and Ismail Ceyhan (2005), “Molecular Analysis of Isoniazid, Rifampicin and Streptomycin Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates from Patients with Tuberculosis in Duzce, Turkey”, Japanese Journal of Infectious Diseases, Vol 58, pp. 309-312.

54. Farahnoosh Doustdar, Azar Dokht Khosravi, Parissa Farnia, Ahmad Reza Bahrmand, Mohammad Reza Masjedi and Ali Akbar Velayati (2008), “Mutations in rpoB Gene and Genotypes of Rifampin Resistant Mycobacterium Tuberculosis Isolates in Iran”, Tanaffos, 7(2), pp. 11-17.

55. Feuerriegel Silke, Barbara Oberhauser, Abu Garawani George et al. (2012),

“Sequence analysis for detection of first-line drug resistance in

Mycobacterium tuberculosis strains from a high-incidence setting”, BioMed Central Microbiology, Vol. 12, pp. 1-10.

56. Flandrois Jean-Pierre, Gérard Lina, Oana Dumitrescu (2014), “MUBII-TB- DB: a database of mutations associated with antibiotic resistance in Mycobacterium tuberculosis”, BioMed Central Bioinformatic, Vol. 15, pp. 107-115.

57. Garcia de Viedma D. (2003), “Rapid detection of resistance in

Mycobacterium tuberculosis: a review discussing molecular approaches”, Clinical Microbiology and Infection, Vol. 9, pp. 349-359.

58. Giffin Robert, Sally Robinson (2009), “Addressing the Threat of Drug-Resistant Tuberculosis: A Realistic Assessment of the Challenge”, Workshop Summary of National Academy of Sciences, Washington, DC 20001.

59. Gladys Guadalupe Lopez Avalos, Ernesto PradoMontes de Oca (2012), “Classic and New Diagnostic Approaches to Childhood Tuberculosis”, Journal of Tropical Medicine, Vol. 2012, pp. 1-12.

60. Guo Jian-Hua, Wen-Liang Xiang, Qing-Rong Zhao et al. (2008), “Molecular Characterization of Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis lsolates from Sichuan Province in China”, Japanese Journal of Infectious Diseases, Vol. 61, pp. 264-268.

61. Helb Danica, Jones Martin, Story Elizabeth et al. (2010), “Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On- Demand, Near-Patient Technology”, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 48, No. 1, pp. 229-237.

62. Hillemann D., T. Kubica, R. Agzamova, B. Venera et al. (2005), “Rifampicin and isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis strains isolated from patients in Kazakhstan”, International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, Vol. 9, No. 10, pp. 1161-1167.

63. JlAO Wei-wei, Mokrousov Igor, SUN Gui-zhi et al. (2007), “Molecular characteristics of rifampin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Beijing, China”, Chinese Medical Journal, Vol. 120, No. 9, pp. 814 – 819.

64. Jun-ichiro Sekiguchi, Tohru Miyoshi-Akiyama, Ewa Augustynowicz- Kopec’, Zofia Zwolska, Fumiko Kirikae, Emiko Toyota, Intetsu Kobayashi, Koji Morita, Koichiro Kudo, Seiya Kato, Tadatoshi Kuratsuji, Toru Mori, and Teruo Kirikae (2007), “Detection of Multidrug Resistance in

Mycobacterium tuberculosis’’, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 45, No. 1, pp. 179-192.

65. Kenneth Todar (2009), Tuberculosis, Online Textbook of Bacteriology, Department of Bacteriology University of Wisconsin-Madison (USA)

66. Keshavjee Salmaan, Farmer Paul E. (2012), “Tuberculosis, Drug Resistance, and the History of Modern Medicine”, New England Journal of Medicine, Vol. 367, pp. 931-936.

67. Khadka JB, B.Maharjan, DR Bhatta, P Ghimi re (2013), “Early diagnosis of MDR-TB cases directly on sputum specimens by rapid molecular method”,

International Journal of Microbiology Research and Reviews, Vol. 1 (6), pp. 92-96.

68. Khosravi Azar Dokht, Hamed Goodarzi, Seyed Mohammad Alavi (2012), “Detection of genomic mutations in katG, inhA and rpoB genes of Mycobacterium tuberculosis isolates using polymerase chain reaction and multiplex allele-specific polymerase chain reaction”, Brazilian Journal of Infectious Diseases, Vol. 16, No. 1, pp. 57-62.

69. Kilic Abdullah, Wonder Drake (2006), “Advances in the Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis and Detection of Drug Resistance”, Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology (Springer Science+Business Media, LLC, 233 Spring Street, New York, NY 10013, USA), pp. 387-410.

70. Kim S.J. (2005), “Drug-susceptibility testing in tuberculosis: methods and reliability of results”, European Respiratory Journal, Vol. 25, No. 3, pp. 376-379.

71. Kolyva Anastasia S., Petros C. Karakousis (2012), “Old and New TB Drugs: Mechanisms of Action and Resistance”, Understanding Tuberculosis – New Approaches to Fighting Against Drug Resistance, Chapter 9, ISBN 978-953¬307-948-6, Publisher: InTech

72. Kouassi N’Guessan, Brossier Florence, Veziris Nicolas, AKA N’guetta, Ekaza Euloge, Nahoua Iremine, Kouakou Jacquemin, Dosso Mireille, Sougakoff Wladimir and Jarlier Vincent (2008), “Molecular characterization of Isoniazid and Rifampicin resistance strains of Mycobacterium tuberculosis isolated from new tuberculosis cases in Lagunes Region (Cote D’Ivoire)”, Scientific Research and Essay, Vol.3 (7), pp. 312-315.

73. Ling Daphne I., Zwerling Alice A., Pai Madhukar (2008), “Rapid diagnosis of drug-resistant TB using line probe assays: from evidence to policy”, Expert review of Respiratory Medicine, Vol. 2, No. 5, pp. 583-588.

74. Lockman Shahin (2011), “A New Era: Molecular Tuberculosis Diagnosis”, http://www.medscape.com/viewarticle/745030

75. Manzour Hernando Hazbon (2004), “Recent advances in molecular methods for early diagnosis of tuberculosis and drug-resistant tuberculosis”, Biomedica ISSN 0120-4157, Vol. 24, suppl. 1

76. Marinus Barnard, Heidi Albert, Gerrit Coetzee, Richard O’Brien, and Marlein E. Bosman (2008), “Rapid Molecular Screening for Multidrug- Resistant Tuberculosis in a High-Volume Public Health Laboratory in South Africa”, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, Vol 177. pp 787-792.

77. Mark T. McCammon, John S. Gillette, Derek P. Thomas, Srinivas V. Ramaswamy, Edward A. Graviss, Barry N. Kreiswirth, Jan Vijg, and Teresa N. Quitugua (2005), “Detection of rpoB Mutations Associated with Rifampin Resistance in Mycobacterium tuberculosis Using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis”, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 49, No. 6, pp. 2200-2209.

78. Maysaa El-Sayed Zaki, Nadia Hassanin (2006), “DNA sequencing analysis of rpoB gene mutation in Rifampicin resistant Mycobacterium tuberculosis’”, Journal of Rapid Methods & Automation in Microbiology, Vol.14, Issue 3, pp. 237-248.

79. Migliori G. B., R. Centis, L. D’Ambrosio et al. (2012), “Totally Drug- Resistant and Extremely Drug-Resistant Tuberculosis: The Same Disease?”, Clinical Infectious Diseases, Vol. 54 (9), pp. 1379-1380.

80. Miguel Viveiros, Clara Leandro, Liliana Rodrigues, Josefina Almeida, Rosa rio Bettencourt, Isabel Couto, Lurdes Carrilho, Jose’ Diogo, Ana Fonseca, Lui’s Lito, Joa~o Lopes, Teresa Pacheco, Mariana Pessanha, Judite Quirim, Lui’sa Sancho, Max Salfinger, and Leonard Amaral (2005), “Direct Application of the INNO-LiPA Rif.TB Line-Probe Assay for Rapid Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex Strains and Detection of Rifampin Resistance in 360 Smear-Positive Respiratory Specimens from an Area of High Incidence of Multidrug-Resistant Tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 43, No. 9, pp. 4880-4884.

81. Minion Jessica., Pai Madhukar (2010), “Expanding the Role of the Microscopic Observation Drug Susceptibility Assay in Tuberculosis and HIV Management”, Clinical Infectious Diseases, Vol. 50, pp. 997-999.

82. Miotto Paolo, Saleri Nuccia, Dembele Mathurin et al. (2009), “Molecular detection of rifampin and isoniazid resistance to guide chronic TB patient management in Burkina Faso”, BioMed Central Infectious Diseases, Vol. 9: 142.

83. Montoya Jaime C., Maria Sheila Magalonzo-De Jesus, Gloria Reclusado et al. (2007), “Characterization of Rifampicin Resistance in Philippine Isolates of Mycobacterium tuberculosis by Mutation of the rpoB Gene”, Philippine Journal of Science, Vol. 136, No. 2, pp. 147-153.

84. Moore David A.J., Carlton A.W. Evans, Robert H. Gilman et al. (2007), “Microscopic-Observation Drug-Susceptibility Assay for the Diagnosis of TB”, New England Journal of Medicine, Vol. 355, No. 15, pp. 1539-1550.

85. Müller Borna, Sonia Borrell, Graham Rose, Sebastien Gagneux (2013), “The Heterogeneous Evolution of Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis’”, Trends Genet, Vol. 29 (3), pp. 160-169.

86. Naga Suresh, Urvashi Balbir Singh, Chhavi Gupta, Jyoti Arora, Tanu Rana, Jyotish Chandra Samantaray (2007), “Rapid detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis directly from stained sputum smears using single-tube nested polymerase chain reaction deoxyribonucleic acid sequencing”, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, Vol. 58, pp. 217-222.

87. Nathanson E., Nunn P., Uplekar M., Floyd K., Jaramillo E., Lonnroth K., Weil D., Raviglione M. (2010), “MDR Tuberculosis – Critical Steps for Prevention and Control”, New England Journal of Medicine, Vol. 363, pp. 1050-1058.

88. Negi SS, Singh U, Gupta S, Khare S, Rai A, Lal S (2009), “Characterization of rpoB gene for detection of rifampicin drug resistance by SSCP and sequence analysis”, Indian Journal of Medical Microbiology, Vol. 27, Issue 3, pp. 226-230.

89. Nghiem Ngoc Minh, Nguyen Van Bac, Nguyen Thai Son, Vu Thi Kim Lien, Chu Hoang Ha, Nguyen Huu Cuong, Cung Thi Ngoc Mai, Thanh Hoa Le (2012), “Molecular Characteristics of Rifampin- and Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains Isolated in Vietnam”, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 50, No. 3, pp. 598-601.

90. Ngo Viet Quynh Tram, Nguyen Hoang Bach, Nguyen Thi Chau Anh et al. (2012), “Preliminary remarks on assembly whole genome sequencing of MDR M. tuberculosis isolated in Vietnam”, Journal of Infection in Developing Countries, Vol. 6, No. 1, pp. 95-96.

91. Nguyen Binh Hoa, Dinh Ngoc Sy, Nguyen Viet Nhung, Edine W Tiemersma, Martien W Borgdorff và Frank GJ Cobelens (2010), “National survey of tuberculosis prevalence in Viet Nam”, Bulletin of the World Health Organization, Vol. 88, No. 4, pp. 273-280.

92. Nguyen T. Huong, Nguyen T. N. Lan, Frank G. J. Cobelens et al. (2006), “Antituberculosis Drug Resistance in the South of Vietnam: Prevalence and Trends”, Journal of Infectious Diseases, Vol. 194, pp. 1226-1232.

93. Nguyen T. Huong, Marleen Vree, Bui D Duong, Vu T Khanh (2007), “Delays in the diagnosis and treatment of tuberculosis patients in Vietnam: a cross-sectional study”, BioMed Central Public Health, Vol. 7: 110.

94. Nguyen T. Mai Huyen, Edine W Tiemersma, Nguyen T.N. Lan, Frank GJ Cobelens et al (2010), “Validation of the GenoType® MTBDRplus assay for diagnosis of multidrug resistant tuberculosis in South Vietnam”, BioMed Central Infectious Diseases, Vol. 10, pp. 1-8.

95. Nguyen Thi Quynh Nhu, Dang Thi Minh Ha, Nguyen Duc Anh, Do Dang Anh Thu et al. (2013), “Evaluation of Xpert MTB/RIF and MODS assay for the diagnosis of pediatric tuberculosis”, BioMedCentral Infectious Diseases, Vol. 13 (31), pp. 1-9

96. Ogbaini-Emovon E. (2009), “Current trends in the laboratory diagnosis of tuberculosis”, Benin Journal of Postgraduate Medicine, Vol. 11, pp. 79-90.

97. Pai Madhukar, Shriprakash Kalatri, Keertan Dheda (2006), “New tools and emerging technologies for the diagnosis of tuberculosis: Part II. Active tuberculosis and drug resistance”, Expert Review of Molecular Diagnostics, Vol. 6, No. 3, pp. 423-432.

98. Palomino J. C. (2006), “Newer Diagnostics for Tuberculosis and Multi-Drug Resistant Tuberculosis”, Current Opinion in Pulmonary Medicine, Vol. 12, No. 3, pp. 172-178.

99. Palomino Juan Carlos, Sylvia Cardoso Leao, Viviana Ritacco (2007), Tuberculosis 2007 – From basic science to patient care, Tuberculosis Textbook, First Edition.

100. Perdigao J., Macedo R., Silva C., Pinto C. (2010), “Tuberculosis drug- resistance in Lisbon, Portugal: a 6-year overview”, Clinical Microbiology andInfection, Vol. 17, No. 9, pp. 1397-1402.

101. Phillips O. A., Edet Ekpenyong Udo, Reny Varghese (2012), “Antimycobacterial Activities of Novel 5-(1H-1,2,3-Triazolyl) Methyl Oxazolidinones”, Tuberculosis Research and Treatment, Vol. 2012, Article ID 289136, pp. 1-7.

102. Poudel Ajay, Chie Nakajima, Yukari Fukushima et al. (2012), “Molecular Characterization of Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Isolated in Nepal”, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 56, No. 6, pp. 2831-2836.

103. Rabia Johnson, Elizabeth M. Streicher, Gail E. Louw, Robin M. Warren, Paul D. van Helden, and Thomas C. Victor (2006), “Drug Resistance in

Mycobacterium tuberculosis’’, Current Issues in Molecular Biology, Vol. 8, pp. 97-112.

104. Richter Elvira, Rusch-Gerdes Sabine; Hillemann Doris (2009), “Drug- susceptibility Testing in TB: Current Status and Future Prospects”, Expert Review of Respiratory Medicine, Vol. 3, No. 5, pp. 497-510.

105. Sandgren Andreas, Michael Strong, Preetika Muthukrishnan et al. (2009), “Tuberculosis Drug Resistance Mutation Database”, Public Library of Science (PloS) One, Vol. 6, Issue 2, pp. 132-136.

106. Santos Lorena Cristina (2012), “Review: The Molecular Basis of Resistance in Mycobaterium tuberculosis”, Open Journal of Medical Microbiology, Vol. 2, pp. 24-36.

107. Shah N. S., N. T. N. Lan, M. N. T. Huyen, K. Laserson et al. (2009), “Validation of the line-probe assay for rapid detection of rifampicin-resistant

Mycobacterium tuberculosis in Vietnam”, International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, Vol. 13, No. 2, pp. 247-252.

108. Sharma N , Sharma V , Singh PR, Jawed B et al. (2013), “Tuberculosis and Molecular Diagnosis”, Review articles, Webmed Central BIOTECHNOLOGY, Vol. 4, No. 2, pp. 1-12.

109. Singh P., VM Katoch (2006), “Multi-drug resistant tuberculosis: Current status and emerging tools for its management in India”, Journal of communicable diseases, Vol. 38 (3), pp. 216-229.

110. Sulochana Somasundaram, Akila Ram, Laavanya Sankaranarayanan (2014), “Isoniazid and Rifampicin as Therapeutic Regimen in the Current Era: A Review”, Journal of Tuberculosis Research, Vol. 2, pp. 40-51.

111. Thirumurugan Ravibalan, Kathirvel Maruthai, Antony V. Samrot, and Muthuraj Muthaiah (2014), “Characterization of katG and rpoB gene mutations in Multi Drug Resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates”, International Journal of Current Microbiology and Apply Sciences, Vol. 3, No. 9, pp. 1072-1080.

112. Toit K., Mitchell S. , Balabanova Y. et al. (2012), “The Colour Test for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis strains”, International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, Vol. 16, No. 8, pp. 1113-1118.

113. Tran N. Buu, N. T. M. Huyen, N. T. N. Lan, H. T. Quy, N. V. Hen, M. Zignol, M. W. Borgdorff, F. G. J. Cobelens, D. van Soolingen (2009), “The Beijing genotype is associated with young age and multidrug-resistant tuberculosis in rural Vietnam”, International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, Vol. 13, No. 7, pp. 900-906.

114. Tran N. Buu, N. T. M. Huyen, Nguyen T. N. Lan, Hoang T. Quy, Nguyen V. Hen, M. Zignol, M. W. Borgdorff, F. G. J. Cobelens, D. van Soolingen (2009), “Mycobacterium tuberculosis Genotype and Case Notification Rates, Rural Vietnam, 2003-2006”, Emerging Infectious Diseases, Vol. 15, No. 10, pp. 1570-1577.

115. Tran N. Buu, D. van Soolingen, Mai N.T. Huyen, Nguyen T. N. Lan, Hoang T. Quy, Edine W. Tiemersma, Kristin Kremer, Martien W. Borgdorff, Frank G. J. Cobelens (2012), “Increased Transmission of Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype Strains Associated with Resistance to Streptomycin: A Population-Based Study”, Public Library of Science (PloS) One, Vol. 7, Issue 8, pp. 1-10.

116. Valcheva Violeta, Mokrousov Igor (2011), “Drug-resistance in Mycobacterium tuberculosis: Molecular basis and genotypic detection”, Biotechnology and Biotechnological Equipment, Vol. 25 (4) suppl., pp. 18-23.

117. Van Deun A., L. Barrera, I. Bastian, L. Fattorini et al. (2009), “Mycobacterium tuberculosis Strains with Highly Discordant Rifampin Susceptibility Test Results”, Journal of Medical Microbiology, Vol. 47, No. 11, pp. 3501-3506.

118. Velayati Ali Akbar, Parissa Farnia, Mohammad Reza Masjedi (2013), “The totally drug resistant tuberculosis (TDR-TB)”, Int J Clin Exp Med, Vol. 6 (4), pp. 307-309.

119. Vibol Iem, Silaphet Somphavong, Yves Buisson, Nicolas Steenkeste, Franck Breysse, Monique Chomarat, et al. (2013), “Resistance of Mycobacterium tuberculosis to antibiotics in Lao PDR: first multicentric study conducted in 3 hospitals”, BioMed Central Infectious Diseases, Vol. 13: 275.

120. Vinnard C. et al (2011), “Isoniazid-Resistant Tuberculosis, Taiwan, 2000-2010”, Emerging Infectious Diseases, Vol. 17, No. 9, pp. 1769-1770.

121. Werngren J., Lisbeth Klintz, Sven E. Hoffner (2006), “Evaluation of a Novel Kit for Use with the BacT/ALERT 3D System for Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis’’, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 44, No. 6, pp. 2130-2132

122. Weyer Karin, Fuad Mirzayev, Giovanni Battista Migliori et al. (2013), “Rapid molecular TB diagnosis: evidence, policy making and global implementation of Xpert MTB/RIF”, European Respiratory Journal, Vol. 42, pp. 252-271.

123. WHO (2008), Molecular line probe assays for rapid screening of patients at risk of multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB)

124. WHO (2008), Anti-Tuberculosis drug resistance in the world, Fourth Global Report. The WHO/IUATLD Global Project on Anti-tuberculosis Drug Resistance Surveillance 2002-2007.

125. WHO (2009), Global Tuberculosis Control: EPIDEMIOLOGY,

STRATEGY, FINANCING.

126. WHO (2011), Global tuberculosis control: WHO report 2011.

127. WHO (2013), Global tuberculosis report 2013.

128. WHO (2014), Global tuberculosis report 2014.

129. WHO (2012), Multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) 2012 Update.

130. Yang Song, Min Zhong, Yaoting Zhang, Yiwei Wang (2011), “Rapid detection of rpoB and katG genes from the sputum of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction (PCR)-direct sequencing analysis”, African Journal of Microbiology Research, Vol. 5, No. 26, pp. 4519-4523.

131. Zenteno-Cuevas R., Zenteno JC., Cuellar A. et al. (2009), “Mutations in rpoB and katG genes in Mycobacterium isolates from the Southeast of Mexico”, Memories of the Oswaldo Cruz Institute, Rio de Janeiro, Vol. 104, No. 3, pp. 468-472

132. Zhang Y., Yew W. W. (2009), “Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis’’, International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, Vol. 13, No. 11, pp. 1320-1330.

TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1. VI KHUẨN LAO 4

1.2. TÌNH HÌNH MẮC BỆNH LAO 8

1.3. VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC 16

1.4. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN LAO KHÁNG THUỐC 23

1.5. CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN MỨC ĐỘ KHÁNG THUỐC 38

1.6. NHẬN ĐỊNH VỀ CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC… 43

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 45

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

2.3. CÁC KỸ THUẬT ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 47

2.4. CÁC THIẾT BỊ, DỤNG CỤ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 68

2.5. CÁC HÓA CHẤT , NGUYÊN LIỆU KHÁC 68

2.6. XỬ LÝ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 69

2.7. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 69

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 72

3.1. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA MẪU NGHIÊN CỨU 72

3.2. MỨC ĐỘ ĐỀ KHÁNG THUỐC KHÁNG LAO DÒNG THỨ NHẤT

CỦA CÁC VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP ĐƯỢC 75

3.3. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH Tự PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 76

3.4. SO SÁNH MỨC ĐỘ ĐỀ KHÁNG THUỐC KHÁNG LAO THEO CÁC

YẾU TỐ KHÁC NHAU 92

Chương 4: BÀN LUẬN 98

4.1. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA MẪU NGHIÊN CỨU 99

4.2. MỨC ĐỘ ĐỀ KHÁNG THUỐC KHÁNG LAO DÒNG THỨ NHẤT

CỦA CÁC VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP ĐƯỢC 106

4.3. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN 114

4.4. SO SÁNH MỨC ĐỘ ĐỀ KHÁNG THUỐC KHÁNG LAO THEO CÁC

YẾU TỐ KHÁC NHAU 130

KẾT LUẬN 138

KIẾN NGHỊ 140

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Mẫu hồ sơ bệnh nhân nghiên cứu Phụ lục 2: Một số quy trình tham khảo Phụ lục 3: Danh sách bệnh nhân nghiên cứu

ADN DANH MUC CÁC CHỮ VIẾT TẮT •

Acid Deoxyribonucleic

AFB Acid-Fast Bacillus (Trực khuẩn kháng acid)

AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải)

ARN Acid ribonucleic

AT Adenine và Thymine

bp

CFU Base pair (Cặp bazơ, đơn vị đo chiều dài của phân tử ADN) Colony-Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

CTCLQG Chương trình chống lao quốc gia

DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Điện di gel gradient biến

ELISA tính nồng độ)

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn men)

EMB Ethambutol

FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer (Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang)

GC Guanine và Cytosine

HIV Human Immunodeficiency Virus (Virus gây suy giảm miễn dịch ở người)

INH Isoniazid

IUATLD International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (Liên hiệp quốc tế chống Lao và Bệnh phổi)

katG Gen mã hóa catalase peroxidase

MAS-PCR Multiplex Allele Specific – PCR (PCR với nhiều alen đặc hiệu)

MDR-TB Multidrug-Resistant TB (Bệnh lao đa kháng thuốc)

MIC Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube (ồng môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn lao có thể phát huỳnh quang)

MTB Mycobacterium tuberculosis (Vi khuẩn lao)

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (Kỹ thuật đa hình sử dụng men phân cắt giới hạn)

Single-Strand Conformation Polymorphism (Đa hình cấu hình sợi đơn) Rifampicin

RNA Polymerase Beta subunit (gen mã hoá cho tiểu phần beta – subunit ARN polymerase).

Rifampicin Resistance-Determining Region (Vùng xác định đề kháng Rifampicin)

Tuberculosis (Bệnh lao)

Melting temperature (Nhiệt độ biến tính) thành phố Hồ Chí Minh

World Health Organisation (Tổ chức Y tế thế giới)

Extensive Drug Resistance TB (Bệnh lao siêu kháng thu ốc hoặc cực kháng)

Trang

Hình 1.1. Vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis dưới kính hiển vi điện tử 4

Hình 1.2. a. Nhuộm Ziehl-Neelsen vi khuẩn lao 5

b. Vi khuẩn lao được nuôi cấy trên môi trường Löwenstein- Jensen Hình 1.3. Cấu trúc lớp vỏ của Mycobacterium tuberculosis 7

Hình 1.4. Bản đồ tỷ lệ mắc bệnh lao, 2013 9

Hình 1.5. Bản đồ tỷ lệ mắc lao mới có MDR-TB 18

Hình 1.6. Bản đồ tỷ lệ mắc lao đã điều trị có MDR-TB 18

Hình 1.7. Cơ chế phát triển tỉnh kháng thuốc ở vi khuẩn lao 20

Hình 1.8. Kỹ thuật MGIT trên 2 ổng xét nghiệm 27

Hình 1.9. Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tự dùng bản gel polyacrylamide 28

Hình 1.10. Các strip LiPA với các kiểu đột biến khác nhau 30

Hình 1.11. Hình biểu diễn cơ chế hoạt động của phân tử beacon 32

Hình 1.12. Hình biểu diễn cơ chế hoạt động của mẫu dò Taqman 34

Hình 1.13. Hình biểu diễn cơ chế hoạt động của mẫu dò FRET 35

Hình 1.14. Hệ thong Gene Xpert 37

Hình 1.15. Bản đồ đánh giá tỷ lệ nhiễm HIVở những trường hợp lao mới và lao 39 tái phát năm 2013

Hình 2.1. Thử nghiệm Niacin 51

Hình 2.2. Thử nghiệm khử Nitrate 51

Hình 2.3. Hình ảnh kháng sinh đồ lao theo phương pháp tỷ lệ 52

Hình 2.4. Hình ảnh minh họa đọc kết quả kháng sinh đồ theo phương pháp tỷ lệ 52 Hình 2.5. Giao diện ứng dụng Primer3 57

Hình 2.6. Trình tự đoạn gen rpoB đăng kỷ trên ngân hàng gen NCBI 58

Hình 2.7. Các cặp mồi đặc hiệu cho gen rpoB được thiết kế bằng Primer3 59

Hình 2.8. Trình tự nhân bản gen rpoB và vị trí gắn mẫu dò 60

Hình 2.9. Trình tự nhân bản gen katG và vị trí gắn mẫu dò 60

Hình 2.10. Giao diện hệ thống “Dữ liệu đột biến kháng thuốc chổng lao” 67

Hình 3.1. Đột biến gen katG trên các codon 200 (AAA^CAG), 203 (ACC85 GCG), 215 (GAT^GTT) của các chủng kháng INH + STM/EMB Hình 3.2. Đột biến gen katG trên các codon 315 (AGC^ACC), 317 (ATT85 GTG), 328 (TGG^CGT), 329 (GAT^GGC) của các chủng kháng INH + STM/EMB

Hình 3.3. Đột biến gen katG trên các codon 349 (GGC^GTG), 350 (GCG85 AGC) của các chủng kháng INH + STM/EMB

Hình 3.4. So sánh các đoạn gen rpoB của các chủng đa kháng và chủng H3 7Rv 89

Hình 3.5. So sánh các đoạn gen katG của các chủng kháng INH và chủng H37Rv 90

Hình 3.6. Khuẩn lạc của M. tuberculosis trên môi trường nuôi cấy 91

Hình 3.7. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen rpoB bằng cặp mồi rpoB-F và rpoB-R 91

Hình 3.8. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen katG bằng cặp mồi katG-F và katG-R 91

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Trang

Biểu đồ 1.1. Đánh giá xu hướng tử vong do bệnh lao trong giai đoạn 1990 – 2013 10

và dự báo tỷ lệ tử vong do bệnh lao trong giai đoạn 2014 – 2015 Biểu đồ 1.2. Số lượng lưu hành bệnh lao tại Việt Nam (trên 100.000 dân) 12

Biểu đồ 1.3. Tỷ lệ tử vong do bệnh lao tại Việt Nam (trên 100.000 dân) 12

Biểu đồ 3.1. Phân bổ theo giới 72

Biểu đồ 3.2. Phân bổ vi khuẩn lao theo nhóm tuổi và vùng cư trú 75

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Đánh giá tình hình bệnh lao tại Việt Nam, 2013 12

Bảng 1.2. Kết quả phát hiện bệnh nhân lao năm 2014 tại Việt Nam 13

Bảng 1.3. Đánh giá tình hình lao đa kháng thuốc tại Việt Nam, 2013 19

Bảng 2.1. Thang đọc kết quả theo CTCLQG-Bộ Y tế 49

Bảng 2.2. Tỷ lệ kháng thuốc tiêu chuẩn đối với một sổ thuốc kháng lao 53

Bảng 2.3. Kết quả tách chiết ADN một sổ chủng lao đa kháng 54

Bảng 2.4. Kết quả tách chiết ADN một sổ chủng lao đơn kháng 54

Bảng 2.5. Trình tự tham khảo của các cặp mồi rpoB và katG 56

Bảng 2.6. Các primer dùng để phát hiện và khuếch đại gen rpoB và katG 60

Bảng 3.1. Phân bố theo nhóm tuổi 72

Bảng 3.2. Phân bổ theo địa phương 73

Bảng 3.3. Phân bổ theo loại bệnh phẩm 73

Bảng 3.4. Phân bổ theo các yếu tổ khác 74

Bảng 3.5. Phân bổ vi khuẩn lao theo tuổi và vùng cư trú 74

Bảng 3.6. Tỷ lệ đề kháng thuốc chổng lao dòng thứ nhất 75

Bảng 3.7. Các kiểu hình kháng thuốc 76

Bảng 3.8. Kết quả giải trình tự và phát hiện đột biến trên gen rpoB 77

Bảng 3.9. Kết quả xác định trình tự gen rpoB các chủng đa kháng 77

Bảng 3.10. Đặc điểm đột biến gen rpoB ở các chủng lao kháng RIF 79

Bảng 3.11. Tần sổ các đột biến ở các codon trên gen rpoB của các chủng lao 80

kháng RIF

Bảng 3.12. Tần số các đột biến trên các codon khác nhau của đoạn gen rpoB 81

Bảng 3.13. Kết quả giải trình tự và phát hiện đột biến trên gen katG 82

Bảng 3.14. Kết quả xác định trình tự gen katG 82

Bảng 3.15. Liên quan của vị trí đột biến trên gen katG đến kháng INH 86

Bảng 3.16. Tần sổ các đột biến ở các codon trên gen katG của các chủng lao 87

kháng INH

Bảng 3.17. Các kiểu đột biến xảy ra trên đoạn gen katG liên quan đặc tỉnh kháng 87 thuốc chổng lao

Bảng 3.18. Sự phân bổ kháng thuốc theo tiền sử dùng thuốc kháng lao 92

Bảng 3.19. Sự phân bổ kháng thuốc RIF theo tiền sử dùng thuốc kháng lao 92

Bảng 3.20. Sự phân bổ kháng thuốc INH theo tiền sử dùng thuốc kháng lao 93

Bảng 3.21. Sự phân bổ kháng thuốc EMB theo tiền sử dùng thuốc kháng lao 93

Bảng 3.22. Sự phân bổ kháng thuốc STM theo tiền sử dùng thuốc kháng lao 94

Bảng 3.23. Sự phân bổ kháng thuốc theo vùng cư trú của bệnh nhân 94

Bảng 3.24. Sự phân bổ kháng thuốc theo nhóm tuổi trên/dưới 60 tuổi 95

Bảng 3.25. Sự phân bổ kháng thuốc theo đánh giá sổ lượng trực khuẩn khi nhuộm 95 Ziehl-Neelsen

Bảng 3.26. Sự phân bổ kháng thuốc theo giới tính 96

Bảng 3.27. Sự phân bổ kháng thuốc theo kết quả xét nghiệm HIV 96

Bảng 3.28. Sự phân bổ đột biến gen rpoB theo tiền sử dùng thuốc kháng lao 97

ở các chủng kháng RIF

Bảng 3.29. Sự phân bổ đột biến gen katG theo tiền sử dùng thuốc kháng lao 97

ở các chủng kháng INH

Bảng 4.1. Tỷ lệ lao đa kháng tại Việt Nam 111

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 2.1. Quy trình giải trình tự gen 64

Sơ đồ 2.2. Sơ đồ nghiên cứu 71