Sử dụng multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori

Cho đến nay, các nhà nghiên cứu đều thống nhất cho rằng, gần một nửa dân số trên thế giới bị nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori [7,2]. Loại vi khuẩn Gram-âm này đã gây ra rất nhiều rối loạn nghiêm trọng về tiêu hoá, bao gồm viêm loét dạ dày và hành tá tràng với biểu hiện nặng nhất là ung th− dạ dày [4].

Cũng như nhiều năm trước đây, ngày nay, việc phát hiện và chẩn đoán các bệnh do nhiễm khuẩn Helicobacter pylori vẫn còn là mối quan tâm của các nhà khoa học, vì vi khuẩn hết sức đa dạng về mặt sinh học [3,5]. Một vài nghiên cứu cho thấy, nếu các cặp primers thiết kế cho phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn H. pylori ở các nước phương Tây không hiệu lực khi phát hiện các chủng châu ¸ [8].Việt Nam, vi khuẩn Helicobacter pylori, theo nghiên cứu được phân lập từ  các bệnh nhân có thể khiếm khuyết gien cagA hoặc gien Urease B [6]. Do thế, nếu chỉ tiến hành PCR đơn để nhằm phát hiện một gien thì các kết quả âm tính giả có thể xảy ra. Để khắc phục nhược điểm này chúng tôi đề nghị sử dụng Multiplex PCR để khuyếch đại đồng thời nhiều gien trong một ống nghiệm. Phương pháp này có −u điểm là nhanh, rẻ tiền và cho nhiều thông tin về vi khuẩn hơn là PCR đơn, ba gien mã hóa cho ba protein bệnh lý: UreaseB, CagA và HP1125 – một protein màng ngoài của vi khuẩn – được lựa chọn cho thử nghiệm.

Mục tiêu nghiên cứu là đánh giá khả năng sử dụng Multipex PCR trong chẩn đoán vi khuẩn Helicobacter pylori trong các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân.

I. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

1. Đối tượng

Sinh thiết của người bệnh bị loét dạ dày chưa qua điều trị kháng sinh được lấy bằng máy nội soi ống mềm 2T-10 (Olympus-Nhật bản) và được giữ trong môi trường vận chuyển (theo Seelinger H.P.J và Schroter G.,1990) và được bảo quản ở -800C.

2. Phương pháp

Phân lập vi khuẩn Helicobacter pylori từ sinh thiết bệnh nhân.

Sinh thiết của bệnh nhân được nghiền kỹ, sau đó dịch nghiền đ−ợc cấy lên môi trường thạch đặc trưng cho vi khuẩn H.pylori có chứa 7% máu ngựa và một số chất khác nh− kháng sinh [2]. Đĩa có vi khuẩn được đặt trong bình vi hiếu khí của hãng BBL (Becton Dickinson Microbiology  System,  Cockeysville)  ở  370C. Sau  48-72  ngày,  thu  thập  vi  khuẩn  (chủng VNH-85) cho các nghiên cứu tiếp theo.

Công trình nghiên cứu này được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học- Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia. 1

Tách chiết ADN từ vi khuẩn và  sinh thiết bệnh nhân.

*) Từ vi khuẩn: Vi khuẩn H. pylori được thu thập từ đĩa nuôi cấy và rửa 2 lần bằng 1xPBS. Tách ADN của vi khuẩn bằng chế phẩm sinh học QIAmp Tissue Kit.

*) Từ sinh thiết bệnh nhân: Bệnh phẩm đ−ợc nghiền trong dung dịch 1 x PBS, sau đó đ−ợc ủ với Proteinase

K  20mg/ml ở  370C  trong  2  giờ.  Sau  khi được phenol hoá để loại protein, ADN đ−ợc tủa bằng cồn tuyệt đối có bổ sung Natri axetate đến  nồng  độ  cuối  cùng 0,3M.  Độ  sạch  của ADN được kiểm tra bằng ph−ơng pháp điện di trên gel agaroza 0,8%., dung dịch đệm 1xTAE

PCR đơn và Multiplex PCR

*) PCR đơn

5-10ng ADN được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng khuyếch đại gien cagA+, Urease B và Hp1125. Phản ứng được thực hiện trên máy PTC-100TM Programmable Thermal controller.

+) Gien cagA+:

Cặp mồi F1, F2  đ−ợc dùng để khuyếch đại đầu 5 gien cagA+ kích th−ớc 460 bp có trình tự sau:

F1:5-ACC-ATT-GAT-CAA-ACA-ACA- ACA-CC-3

F2:5-AGG-GGG-TTG-TAT-GAT-ATT- TTC-CAT-3

Chu trình nhiệt của phản ứng: 940C1phút 580C 1 phút 720C1 phút Lặp lại 35-40 chu kỳ.

+) Gien ureaseB

Cặp mồi F3, F4  đ−ợc dùng để khuyếch đại toàn bộ gien ureaseB kích th−ớc 1700 bp có trình tự là:

F3:5-CAG-CAT-ATG-AAA-AAG-ATT- AGC-AG-3

F4:5-AAT-GCT-AAA-GAG-TTG-CGC- CAA-G-3

Chu trình nhiệt của phản ứng: 940C 1 phút., 580C 1 phút., 720C 1 phút Lặp lại 35 –40 chu kỳ.

+) Gien Hp1125

Cặp mồi được sử dụng để khuyếch đại 540 bp của đầu 5 của gien có trình tự là:

L:5-ATG-AAG-AGA-TCT-TCT-GTA- TTT-AGT-T-3

R:5-TTA-CTT-CAC-TAA-TTT-GAT- CCA-CT-3

Chu trình nhiệt của phản ứng: 940C 1 phút 550C 1 phút 720C 1 phút Lặp lại 35-40 chu kỳ.

Sản phẩm PCR của từng gen trên đ−ợc kiểm tra trên gel agaroza 0,8%. Đệm điện di 1xTAE

*) Multiplex PCR

Phản ứng được thực hiện với sự có mặt cả 3 cặp mồi của 3 gien: cagA+, Urease B, Hp1125. Phản ứng PCR được tối ưu hoá trong thể tích 25àl: 5ng ADN tổng số được dùng làm khuôn cho phản ứng, 1àM của mỗi cặp mồi, 2,5àl của 10 x dịch đệm, 200àM của mỗi dNTP, 2,5 đơn vị AmpliTaq DNA polymerase, thêm H2O (khử ion và đã khử trùng) đến 25àl.

Chu trình nhiệt của phản ứng: 940C 1 phút 500C 1 phút 30 giây 720C 2 phút

Lặp lại 35 –40 chu kỳ.

Sản  phẩm  của  phản  ứng  Multiplex  PCR được kiểm tra trên gel agaroza 0,8%. Đệm điện di 1xTAE.