Sử dụng phương pháp RT – PCR bán định lượng để đánh giá mức độ sao chép của EGFR ở mô ung thư biểu mô tuyến giáp

Bệnh ung thư ngày càng có xu hướng gia tăng trong những thập niên gần đây không chỉ ở các nước phát triển mà cả với các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, hàng năm trên toàn cầu có khoảng trên 10 triệu người mắc bệnh ung thư và có khoảng trên 6 triệu người chết do căn bệnh này [1]. Ở nước ta, theo số liệu thống kê sơ bộ tại Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh thành, ước tính mỗi năm có khoảng 150.000 trường hợp mới mắc và có khoảng 75.000 người chết vì ung thư [5]. Chính vì thế, việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế ung thư để từ đó tìm ra phương pháp điều trị can thiệp là một lĩnh vực nóng bỏng và đầy trở ngại đối với các nhà Y – Sinh học hiện nay.
Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR), được mã hoá bởi gen tiền ung thư c – erb, là một phân tử glycoprotein bề mặt màng tế bào, trọng lượng phân tử 170.000, gồm một vùng gắn ngoại bào đặc hiệu, một vùng xuyên màng và một vùng trong màng có hoạt tính enzym tyrosine kinase.
Khi một chất gắn kết, ví dụ: yếu tố phát triển tế bào biểu mô (EGF) hoặc yếu tố phát triển tổ chức (TGF – a) gắn với EGFR sẽ gây nên sự phân cực thụ thể và sự tự phosphoryl hóa của vùng có hoạt tính enzym. Điều đó khởi đầu một dòng thác phản ứng tế bào mà kết quả là làm tăng sinh và ảnh hưởng đến các khía cạnh khác của sự tiến triển ác tính của khối u: tăng sinh mạch, di căn và ức chế quá trình chết theo chương trình [6]. Yếu tố phát triển biểu mô (EGF) và thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) có liên quan trong bệnh sinh của nhiều loại ung thư khác nhau, vì vậy là một cái đích hấp dẫn cho liệu pháp phân tử trị liệu ung thư hiện nay.
Nghiên cứu của nhiều tác giả đã chứng minh rằng EGFR được tăng cường tổng hợp ở các tổ chức ung thư khác nhau như: ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, ung thư đầu cổ…Sự tăng cường của EGFR trên bề mặt tế bào ung thư hiện nay được biết là liên quan đến sự tiến triến bệnh, sự phát triển của dạng di căn và tiên lượng xấu đối với bệnh nhân ung thư [5, 6]. Tiếp theo những  nghiên  cứu  trên,  chúng  tôi  tiến  hành nghiên cứu sự biểu hiện của EGFR trên tế bào ung thư biểu mô tuyến giáp với mục tiêu:
Đánh giá mức độ sao chép của EGFR trên mô sinh thiết của bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến giáp so với bệnh nhân u giáp lành tính.
I.    ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG    PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Đối tượng nghiên cứu
    Nhóm nghiên cứu
32 mẫu mô sinh thiết tuyến giáp của bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến giáp, gồm 12 nam và 20 nữ, tuổi từ 19 – 51, được chẩn đoán xác định bằng kết quả tế bào học tại khoa Giải phẫu bệnh lý bệnh viện K Hà Nội.
    Nhóm chứng
16 mẫu mô sinh thiết tuyến giáp của bệnh nhân u tuyến giáp lành tính, gồm 13 nữ và 3 nam, tuổi từ 32 – 75, được chẩn đoán xác định bằng kết quả tế bào học tại khoa Giải phẫu bệnh lý bệnh viện K Hà Nội.
II.    KẾT QUẢ
1.    Phương pháp nghiên cứu
    Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số từ mô sinh thiết
Sử dụng kit Trizol để tách chiết RNA tổng số theo quy trình đã được mô tả trước đây bởi nhóm nghiên cứu của TS.Tạ Thành Văn và cộng sự [7]. RNA tổng số thu được phải đảm bảo nồng độ và độ tinh sạch tối ưu để tổng hợp cDNA
    Kỹ thuật RT – PCR tổng hợp cDNA
5 microgram RNA tổng số thu được sau tách chiết sẽ được sử dụng để tổng hợp cDNA. Quá trình tổng hợp có sử dụng random primer đã pha loãng 20 lần, enzyme MMLV – RT, chất ức chế thuỷ phân RNA, chất ức chế protein và dNTP.
    Kỹ thuật PCR bán định lượng xác  định mức độ sao chép của EGFR
Nồng độ cDNA của tất cả các mẫu chạy PCR là 1000 ng, cặp mồi đặc hiệu với EGFR đã được sử dụng để đánh giá mức độ sao chép của EGFR. Phản ứng PCR được thực hiên theo quy trình đã được mô tả trước đây [3]. Gen nội chuẩn GAPDH được sử dụng để đánh giá chất lượng mẫu và so sánh lượng mẫu sử dụng trong mỗi phản ứng. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm Ethidium Bromide trong vòng 10 – 15phút, sau đó được chụp ảnh và sử lý bằng phần mềm chemidoc iQ 76S00503 để đo mật độ vạch của sản phẩm PCR