Sử dụng phương pháp RT – PCR bán định lượng xác định mức độ sao chép của hip ở mô ung thư biểu mô tuyến giáp

Heparan sulfate interacting protein (HIP) thuộc nhóm protein gắn với ribosome (ribosomal protein L29) để  tham gia điều  hòa  quá  trình phiên  mã. HIP gồm 159 acid amin có trọng lượng phân tử khoảng 24 kDa. Protein này nhận biết những vị trí đặc hiệu trên phân tử heparin/heparan sulfate (HP/ HS). HIP được tổng hợp nhiều ở tế bào nội mạc và tế bào biểu mô trưởng thành [4, 8], có khả năng nhận biết những vị trí đặc hiệu trên phân tử HP/ HS ở bề mặt tế bào và trong khoảng gian bào. Nghiên cứu trên thế giới cũng như các nghiên cứu của nhóm chúng tôi cho thấy HIP được tăng cường tổng  hợp ở các  dòng  tế bào ung thư, đặc  biệt  là dòng tế bào ung thư có độ ác tính cao [6, 9]. Sự tổng hợp của HIP liên quan mật thiết với quá trình phát triển và di căn của tế bào ung thư. Trong một số   nghiên   cứu   gần   đây,   bằng   phương  pháp

RT – PCR Tạ Thành Văn và cộng sự đã phát hiện mRNA của HIP được sao chép với một lượng đáng kể trong mô ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư tuyến tiền liệt trong khi đó không phát hiện được hoặc phát hiện được rất thấp ở mô u xơ [1, 2, 3]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục sử dụng  phương pháp  RT – PCR bán  định lượng  để khảo sát sự sao chép của HIP trong ung thư biểu mô tuyến giáp với mục tiêu:

Đánh giá mức độ sao chép của HIP ở mô ung thư biểu mô tuyến giáp so với mô u giáp lành tính.

I. ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu

Nhóm nghiên cứu

Gồm  32 mẫu  mô  tuyến  giáp  của  bệnh  nhân ung thư biểu mô tuyến giáp trong đó có 12 nam và

20 nữ, tuổi từ 19 – 51, được chẩn đoán xác định bằng  kết  quả  mô  bệnh  học  tại  khoa Giải  phẫu bệnh lý bệnh viện K Hà Nội.

Nhóm chứng

Gồm 16 mẫu mô tuyến giáp của bệnh nhân u tuyến giáp lành tính trong đó có 13 nữ và 3 nam, tuổi từ 32 – 75, được chẩn đoán xác định bằng kết quả mô bệnh học tại khoa Giải phẫu bệnh lý bệnh viện K Hà Nội.

2. Phương pháp nghiên cứu

Kỹ thuật tách chiết RNA tổng  số từ mô sinh thiết

Sử dụng Kit Trizol để tách chiết RNA tổng số theo quy trình đã được mô tả bởi nhóm nghiên cứu của TS.Tạ Thành Văn và cộng sự [2, 3]. RNA tổng số thu được phải đảm bảo nồng độ và độ tinh sạch tối ưu để tổng hợp cDNA

Kỹ thuật RT – PCR tổng hợp cDNA

5 microgram RNA tổng số thu được sau tách chiết  sẽ  được  sử  dụng  để  tổng  hợp  cDNA. Quá trình tổng hợp có sử dụng random primer đã pha loãng 20 lần, enzyme MMLV – RT, chất ức chế thuỷ phân RNA, chất ức chế protein và dNTP.

Kỹ thuật PCR bán định lượng xác  định mức độ sao chép của HIP

Nồng độ cDNA của tất cả các mẫu chạy PCR là 1500 ng, cặp mồi đặc hiệu với HIP có trình tự như sau: HIP – F: 5/ – GTC TAT GGT GCA GAC ATG G – 3/; HIP – R: 5/ – CAG AGA TAT CTA CTC TGA AGC – 3/.

PCR được  tiến  hành  với  tổng  thể  tích 10µl (gồm  1µl buffer 10 X, 2 µl Q sol, 0,25µl 10mM dNTP,  1µl  10  pM  mồi  xuôi  và  ngược,  0,1µl (5 units/µl) Taq polymerase, thể  tích cDNA tuỳ theo mẫu bảo đảm đạt 1500ng, lượng nước thêm vào cho đủ 10µl) (QIAGEN). Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: biến tính 940C – 5 phút, 35 chu kỳ [940C – 50 giây, 580C – 50 giây, 720C – 50 giây],

720C – 10 phút. Gen nội chuẩn GAPDH được sử dụng để đánh giá chất lượng mẫu và so sánh lượng mẫu sử dụng trong mỗi phản ứng. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm Ethidium Bromide trong vòng 10 – 15 phút, sau đó được   chụp   ảnh   và   xử   lý   bằng   phần   mềm Chemidoc iQ 76S00503 để đo mật  độ  vạch  của sản  phẩm  PCR. Mức  độ  sao chép  của  HIP được tính bằng tỷ lệ HIP/GAPDH rồi vẽ đồ thị.