Sự khác biệt về mức độ sao chép Heparan sulphat Interacting Protein ở mô phì đại lành tính, tân sản nội biểu mô và Ung Thư Tuyến Tiền Liệt

Ung thư tuyến tiền liệt (TTL) là một bệnh lý đang được nhiều nhà khoa học trong nước cũng như trên toàn thế giới quan tâm. Đây là căn bệnh ác tính thường gặp ở nam giới trên 50 tuổi, có tỷ lệ mắc bệnh cao, đứng thứ năm trong số các bệnh ung thư ở nam giới. Ở Hoa Kỳ và châu Âu, bệnh xếp thứ hai trong các loại ung thư ở nam giới và có tỷ lệ tử vong cao sau ung thư phổi và ung thư đại tràng [5; 6]. Bệnh thường tiến triển thầm lặng, không có triệu chứng ở giai đoạn sớm, vì thế hầu hết người bệnh không được phát hiện bệnh ở giai đoạn này.

Cũng như một số loại ung thư khác, ung thư TTL là bệnh có thể điều trị hiệu quả nếu phát hiện sớm và chẩn đoán kịp thời. Trong những năm gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của ngành Y Sinh học phân tử, nhiều phương pháp chẩn đoán mới đã được ứng dụng, nổi bật trong số đó là việc tìm những thay đổi đặc hiệu ở mức độ phân tử  hay các marker để chẩn đoán sớm ung thư. Heparan- sulfate Interacting Protein (HIP), một protein bề

mặt tế bào cũng đang được nghiên cứu để ứng dụng như một marker trong chẩn đoán sớm bệnh ung thư. Đây là một protein đã được phát hiện bởi nhóm nghiên cứu của GS. Daniel D. Carson [7]. HIP là một protein có 159 aa, trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa được tổng hợp ở tế bào nội mạc và tế  bào biểu mô trưởng thành. HIP tham gia quá trình liên kết tế bào – tế bào [7; 8] và có khả năng gắn đặc hiệu và chọn lọc với HP/HS. Đây chính là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình phân bào, biệt hoá và di chuyển của tế bào. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, HIP được tăng cường tổn hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư ở cả mức độ RNA thông tin (mRNA) và protein đặc biệt mức độ biểu hiện của HIP phụ thuộc vào giai đoạn phát triển và biệt hoá của tế bào ung thư [1; 4]. Nhằm nghiên cứu khả năng ứng dụng HIP như một marker trong chẩn đoán và tiên lượng ung thư TTL chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu:

Đánh giá mức độ sao chép của HIP ở mô ung thư TTL, tân sản nội biểu mô (PIN độ cao) và phì đại lành tính sử dụng kỹ thuật RT – PCR bán định lượng.

I. ĐỐI  TƯỢNG  VÀ  PHƯƠNG  PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu

30 mẫu mô phì đại lành tính, 12 mẫu mô PIN độ cao, 40 mẫu mô ung thư TTL, đã được lấy từ các bệnh nhân được chẩn đoán xác định tại bệnh viện Việt Đức và bệnh viện Hữu Nghị dựa vào kết quả chẩn đoán lâm sàng và giải phẫu bệnh.

2. Phương pháp nghiên cứu

– Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số: Sử dụng kit Trizon để tách chiết RNA tổng số theo quy trình đã được các tác giả mô tả [2; 3].

– Kỹ thuật tổng hợp ngược cDNA (RT – PCR): đây là quy trình chuyển mRNA thành cDNA nhờ enzym sao mã ngược (Moloney Murine Leukemia Vius   –   Reves    Trancriptase/MMLV   –   RT).   3 microgam RNA tổng số thu đựoc sau tách chiết sẽ được sử dụng để tổng hợp cDNA, quá trình tổng hợp  ngược   này  có  sử   dụng   mồi  ngẫu  nhiên

(Random primer) đã pha loãng 20 lần, dNTP, chất

ức  chế  thủy  phân  RNA (Rnase out), chất  ức  chế proteinase (DTT) và một số hoá chất khác.

– Kỹ thuật PCR bán định lượng: Cặp mồi đặc hiệu với HIP đã được ứng dụng để đánh giá mức độ sao chép của HIP. Nồng độ cDNA của tất cả các mẫu chạy PCR là 500ng, phản ứng RT – PCR được tiến hành với tổng thể tích 20 μl gồm: 1 x Ex

– Taq buffer; 2,5 mM dNTPs; 10 pmol mồi xuôi và

ngược; 1 unit Ex Taq Polymerase (Takara Bio Inc. Kyoto, Japan), 500 ng cDNA. Chu kỳ của phản ứng RT – PCR: 940C – 5 phút; [940C – 50 giây, 580C – 50 giây, 720C – 50 giây] trong 35 chu kỳ; 720C – 5phút; bảo quản ở 40C. Gen GAPDH được dùng để kiểm tra chất lượng cDNA và so sánh lượng mẫu sử dụng trong mỗi phản ứng. Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 2%, sau đó được chụp ảnh và xử lý  bằng phần mềm chemidoc iQ 76S00503 để đo đậm độ vạch của sản phẩm PCR. Tỷ lệ đậm độ vạch của gen HIP/GAPDH ở mô ung thư sẽ được so sánh với mô

PIN độ cao và mô lành tính đối chứng.

Nhiều bằng chứng khoa học đã khẳng định Heparansulphat Interacting Protein (HIP), được tăng cường sao chép và biểu hiện ở một số dòng tế bào ung thư, phụ thuộc vào giai đoạn phát triển và biệt hoá của các tế bào ung thư. Mục tiêu: đánh giá mức độ sao chép HIP ở mô phì đại lành tính, tân nội mạc biểu mô (PIN độ cao) và ung thư tuyến tiền liệt (TTL). Phương pháp nghiên cứu: sử dụng phương pháp RT – PCR bán định lượng để đánh giá mức độ sao chép HIP ở 3 loại mô khác nhau gồm: 40 mẫu mô ung thư, 12 mẫu PIN độ cao, 30 mẫu mô phì đại lành tính. Kết quả: có sự khác biệt rõ về mức độ sao chép HIP. Mức độ sao chép HIP ở mô PIN độ cao thấp hơn mô ung thư song cao hơn mô bình thường. Điều đó gợi cho chúng ta thấy sự tăng cường sao chép HIP ở mô PIN độ cao có thể là dấu hiệu báo trước của tiền ung thư. Kết luận: mức độ sao chép của HIP ở mô phì đại lành tính, PIN độ cao và UTTTL khác biệt nhau một cách rõ rệt. HIP có thể được coi như một marker có giá trị để hướng tới chẩn đoán sớm ung thư TTL.