Sự sao chép Heparansulfate Interacting Protein ở mô ung thư đại trực tràng, polyp và mô ruột bình thường

Bệnh ung thư  là  nguyên nhân gây tử  vong đứng thứ hai, sau các bệnh về tim mạch. Theo thông báo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hằng năm trên thế giới có khoảng 6 triệu người chết vì ung thư với tần suất 130 – 200 /100.000 dân [1]. Tại Việt Nam, mỗi năm có thêm 150.000 người mắc ung thư. Theo các nghiên cứu của WHO, thì ung thư đại trực tràng (K – ĐTT) đứng thứ 3 về tỷ lệ mắc và đứng thứ 2 về tỷ lệ tử vong, chỉ sau ung thư phổi. Tại Mỹ, hằng năm có 131.000 ca mắc và 56.000 ca chết vì K – ĐTT. Ở Việt Nam, theo thống kê của Nguyễn Bá Đức và Đoàn Hữu Nghị thì K – ĐTT đứng thứ năm sau ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư vú và ung thư vòm. Số người mắc K – ĐTT phát hiện được ngày càng gia tăng, theo số liệu thống kê của bệnh viện K Hà Nội: Năm 1991 tỷ lệ là 4,3/100.000 dân, thì đến năm 1999 tỷ lệ đã là 13,3/100.000 dân.
Theo WHO, K – ĐTT là bệnh có thể điều trị hiệu quả nếu phát hiện sớm và chẩn đoán kịp thời. Trong những năm gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của ngành Y Sinh học phân tử, nhiều phương pháp chẩn đoán mới đã được ứng dụng. Nghiên cứu ứng dụng một số marker mới có giá trị trong chẩn đoán bệnh ung thư cũng là một vấn đề đang được quan tâm. Trong quá trình nghiên cứu nhóm protein gắn ái lực với heparin và heparan- sulfat, Daniel D. Carson và cộng sự đã phát hiện ra một protein bề mặt tế bào biểu mô thận người và một số dòng tế bào khác, protein này thuộc nhóm heparansulfate binding protein (HSBP) và được đặt tên là Heparansulfate Interacting Protein (HIP). HIP là một protein có 155 aa, trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa được tổng hợp ở tế bào nội mạc và tế bào biểu mô trưởng thành. HIP tham gia quá trình liên kết tế bào – tế bào [7, 8] và có khả năng gắn đặc hiệu và chọn lọc với HP/ HS. Đây chính là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình phân bào, biệt hoá và di chuyển của tế bào. Các nghiên cứu khác đã cho thấy, HIP được tăng cường tổng hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư ở cả mức độ RNA thông tin (mRNA) và protein Đặc biệt mức độ biểu hiện của HIP phụ thuộc vào giai đoạn phát triển và biệt hoá của tế bào ung thư [2, 3, 4, 5]. Nhằm nghiên cứu khả năng ứng dụng HIP như một marker trong chẩn đoán và tiên lượng K – ĐTT chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu:
Sử dụng kỹ  thuật PCR bán định lượng để đánh giá mức độ sao chép của HIP ở mô K – ĐTT, mô polyp và mô ruột lành tính.
I.    ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG    PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Đối tượng nghiên cứu
Mô ung thư: lấy từ 48 bệnh nhân được chẩn đoán xác định là K – ĐTT tại bệnh viện K Hà Nội dựa vào lâm sàng, cận lâm sàng (nội soi, hoá sinh, XQ và mô bệnh học). Bệnh nhân chỉ bị K – ĐTT, ngoài ra không mắc bất kỳ một loại hình bệnh tật hay ung thư nào khác.
Mô polyp: lấy từ 6 bệnh nhân được chẩn đoán xác định là polyp đại trực tràng tại bệnh viện K Hà Nội dựa vào lâm sàng, cận lâm sàng (nội soi, hoá sinh, XQ và mô bệnh học). Bệnh nhân chỉ bị polyp đại trực tràng, ngoài ra không mắc bất kỳ một loại hình bệnh tật hay ung thư nào khác.
Mô lành tính: Là 20 mẫu mô ruột lành lấy của 20 bệnh nhân ung thư làm đối chứng.
2.    Phương pháp nghiên cứu
–    Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số: Tách chiết RNA là khâu quan trọng để đảm bảo cho sự thành công của giai đoạn tiếp theo. RNA thu được phải đủ độ tinh sạch và không bị đứt  gẫy.  Quy trình tách chiết được thực hiện theo quy trình chuẩn đã được mô tả trước đây bởi  nhóm nghiên cứu của TS. Tạ Thành Văn và cộng sự [3, 4].
–    Kỹ thuật tổng hợp ngược cDNA (RT – PCR): Đây là quy trình chuyển mRNA thành cDNA nhờ enzym sao mã ngược (Moloney Murine Leukemia
Vius – Reves Trancriptase/MMLV – RT). Quá trình tổng hợp ngược này có sử dụng mồi ngẫu nhiên (Random primer) đã pha loãng 20 lần, dNTP, chất ức chế thủy phân RNA (Rnase out), chất ức chế proteinase (DTT) và một số hoá chất khác.
– Kỹ thuật PCR bán định lượng:
Sử dụng quy trình đã được mô tả bởi nhóm nghiên cứu của TS. Tạ Thành Văn và CS [4, 5]. Cặp mồi đặc hiệu với HIP đã được ứng dụng để đánh giá mức độ sao chép của HIP. Gen GAPDH được dùng để kiểm tra chất lượng cDNA và so sánh lượng mẫu sử dụng trong mỗi phản ứng.
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 2%, sau đó được chụp ảnh và xử lý bằng phần mềm chuyên dụng. Tỷ lệ đậm độ vạch của gen HIP/GAPDH ở mô bệnh phẩm ung thư sẽ được so sánh với mô polyp và mô lành tính đối chứng.
Ung thư đại trực tràng là bệnh có thể điều trị hiệu quả nếu được phát hiện sớm và chẩn đoán kịp thời. Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng, Heparansulfate interacting protein (HIP) được tăng cường tổng hợp ở một số dòng tế bào ung thư ở cả mức độ mRNA và protein, đặc biệt mức độ biểu hiện của nó phụ thuộc vào mức độ ác tính của các dòng tế bào này. Mục tiêu: Đánh giá mức độ sao chép của HIP ở mô ung thư đại trực tràng, mô lành tính và mô polyp. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tách chiết RNA tổng số từ 74 mẫu mô (gồm: 48 mẫu mô ung thư, 6 mẫu mô polyp và 20 mẫu mô lành); tổng hợp cDNA; phương pháp PCR bán định lượng đánh giá mức độ sao chép. Kết quả: HIP được tăng cường sao chép rất rõ ở mô ung thư, đặc biệt sự tăng cường sao chép của HIP cũng được biểu hiện tương đối rõ ở mô polyp. Điều đó gợi ý cho chúng ta thấy sự tăng cường sao chép của HIP ở mô polyp có thể là dấu hiệu báo trước của tiền ung thư đại trực tràng. Kết luận: Mức độ sao chép của HIP ở mô ung thư, mô polyp và mô lành tính khác biệt nhau một cách rõ rệt. HIP có thể được coi như một marker có giá trị để chẩn đoán sớm bệnh ung thư đại trực tràng.