TÁC ĐỘNG CỦA FIBRIN GIÀU TIỂU CẦU KẾT HỢP XƯƠNG DỊ LOẠI LÊN TẾ BÀO DÂY CHẰNG NHA CHU NGƯỜI ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ VIÊM NHA CHU

Luận án tiến sĩ y học TÁC ĐỘNG CỦA FIBRIN GIÀU TIỂU CẦU KẾT HỢP XƢƠNG DỊ LOẠI LÊN TẾ BÀO DÂY CHẰNG NHA CHU NGƯỜI ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ VIÊM NHA CHU.Viêm nha chu (VNC) là một bệnh nhiễm trùng mạn tính đa yếu tố do phức hợp các loài vi khuẩn tương tác với mô và tế bào của vật chủ gây giải phóng các chất trung gian gây viêm, dẫn đến sự phá hủy cấu trúc mô nha chu gồm nướu, xương ổ và dây chằng nha chu. VNC là nguyên nhân hàng đầu gây mất răng, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống ở người trưởng thành 6. VNC là một bệnh lý rất phổ biến, trên thế giới tỷ lệ VNC ở người lớn thay đổi từ 10-60% tuỳ thuộc vào tiêu chuẩn chẩn đoán 40. Ở Việt Nam, 96,8% người trưởng thành mắc bệnh viêm nướu và viêm nha chu, tỷ lệ người có cao răng và túi nha chu từ trung bình đến sâu lần lượt là 63,7% và 31,8% 5. Hơn nữa, VNC cũng đã được xác định có liên quan đến một số bệnh toàn thân; do đó việc kiểm soát hay điều trị VNC không chỉ giúp giữ răng mà còn dự phòng bệnh toàn thân và những biến chứng của chúng 50.

Điều trị VNC gồm điều trị không phẫu thuật và điều trị phẫu thuật tuỳ thuộc vào tính chất, mức độ của bệnh, các yếu tố tại chỗ và toàn thân cũng như yêu cầu của bệnh nhân. Điều trị nha chu không phẫu thuật như lấy cao răng và xử lý mặt chân răng có hiệu quả trong sửa chữa những khiếm khuyết liên quan đến bệnh và ngăn sự viêm nha chu tiến triển [102]. Tuy nhiên, sự lành thương sau phương pháp điều trị này thường xảy ra biểu mô bám dính kéo dài, có thể dễ tái phát túi nha chu và chỉ tái tạo phần nhỏ mô nha chu. Tái tạo mô có hướng dẫn (GTR), GTR kết hợp với ghép xương với mức độ điều trị cao hơn; phương pháp này sử dụng màng chắn ngăn tế bào biểu mô tăng sinh bám dính vào bề mặt chân răng trong giai đoạn lành thương, cho phép tế bào dây chằng nha chu và xương ổ răng hình thành xê măng mới và bám dính mô liên kết mới; đây là phương pháp điều trị hứa hẹn vì tạo được khoảng trống cho sự di cư của tế bào dây chằng nha chu (DCNC) và ngăn hình thành biểu mô bám dính kéo dài, nhưng vẫn thiếu tính dẫn tạo tế bào và yếu tố gây biệt hóa tế bào [143]. Để một điều trị có được đặc tính dẫn tạo xương và yếu tố giúp biệt hóa tế bào DCNC cần ứng dụng yếu tố tăng trưởng kích thích các tế bào chịu trách nhiệm trong tái tạo mô nha chu trong đó có sử dụng fibrin giàu tiểu cầu [59].2 Fibrin giàu tiểu cầu (PRF) là vật liệu sinh học thuộc thế hệ thứ hai của tiểu cầu cô đặc chứa những yếu tố tăng trưởng tự thân như PDGF, VEGF, TGF-β có tiềm năng thúc đẩy sự tăng sinh, biệt hóa và di cư của nguyên bào sợi nướu, tế bào DCNC và nguyên bào xương [31]. Những nghiên cứu in vitro cũng cho thấy sử dụng PRF riêng lẻ thúc đẩy sự tăng sinh, di cư và biệt hóa tế bào gốc DCNC thành mô xương [133]. Tuy nhiên tác động của PRF khi kết hợp với vật liệu thay thế xương dị loại lên tế bào gốc DCNC cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ; đây là nguồn tế bào quan trọng trong tái tạo mô nha chu.
Vật liệu ghép thay thế xương nhằm để tăng tái tạo xương quanh khiếm khuyết nha chu với kết quả có thể dự đoán được; trong đó vật liệu ghép thay thế xương dị loại có nguồn gốc từ bò (XBSM) được sử dụng phổ biến bởi tính tương hợp sinh học của vật liệu thường được chọn trong điều trị VNC, hầu hết những nghiên cứu cho thấy sử dụng XBSM cho kết quả thành công về mô học và lâm sàng [105]. Tuy nhiên, XBSM thiếu tính kích tạo xương và có thời gian tiêu kéo dài dẫn đến chậm quá trình hình thành xương mới, do vậy cần kết hợp tác nhân sinh học chứa những yếu tố tăng trưởng rút ngắn thời gian lành thương và tăng tính dẫn tạo xương và kích thích sự trưởng thành của vật liệu ghép [21].
Nghiên cứu lâm sàng sử dụng PRF riêng lẻ hay kết hợp với vật liệu sinh học khác như xương tự thân, đồng loại, dị loại và vật liệu tổng hợp cho kết quả khả quan so với không sử dụng PRF trong điều trị VNC có tiêu xương [27], [98], [113].
Sự kết hợp giữa GTR với XBSM và PRF có khả năng thúc đẩy quá trình lành thương và tái tạo mô nha chu còn chưa được nghiên cứu trên lâm sàng. Vì vậy nghiên cứu này được thực hiện với những mục tiêu sau:
1. Đánh giá hiệu quả phóng thích yếu tố tăng trưởng PDGF và VEGF trong dịch chiết A-PRF kết hợp với vật liệu thay thế xương dị loại in vitro.
2. Xác định mức độ an toàn và tác động của A-PRF kết hợp vật liệu thay thế xương dị loại qua đánh giá độc tính, mức độ tăng sinh và di cư của tế bào gốc dây chằng nha chu người in vitro.3
3. Đánh giá hiệu quả lâm sàng và X quang của A-PRF kết hợp vật liệu thay thế xương dị loại sau 3 và 6 tháng điều trị viêm nha chu có tiêu xương theo chiều dọc.
4. Đánh giá mức độ hiện diện những yếu tố tăng trưởng PDGF, VEGF và TGF-β1 trong dịch khe nướu của người bệnh sau phẫu thuật tái tạo mô nha chu khi có và không có sử dụng A-PRF kết hợp vật liệu thay thế xương dị loại

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt và thuật ngữ Anh – Việt
Danh mục bảng
Danh mục hình
Danh mục biểu đồ
Danh mục sơ đồ
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………………………………1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………………………4
1.1. Tế bào gốc dây chằng nha chu ……………………………………………………………….4
1.2. Fibrin giàu tiểu cầu……………………………………………………………………………….5
1.2.1. Lịch sử phát triển Fibrin giàu tiểu cầu (PRF)……………………………………..5
1.2.2. Những tiến bộ trong quy trình tạo fibrin giàu tiểu cầu…………………………7
1.3. Ảnh hưởng của PRF lên đặc tính sinh học của tế bào dây chằng nha chu…….9
1.3.1. Ảnh hưởng của PRF lên những đặc tính sinh học của tế bào dây chằng
nha chu…………………………………………………………………………………………………..9
1.3.2. Ảnh hưởng của PRF kết hợp vật liệu ghép thay thế xương lên những đặc
tính sinh học của tế bào dây chằng nha chu……………………………………………….11
1.4. Hiệu quả lâm sàng của fibrin giàu tiểu cầu trong điều trị viêm nha chu có tiêu
xương theo chiều dọc …………………………………………………………………………..13
1.4.2. Hiệu quả lâm sàng của PRF trong điều trị viêm nha chu có tiêu xương
theo chiều dọc (IBD) ……………………………………………………………………………..17
1.4.3. Hiệu quả lâm sàng của PRF kết hợp vật liệu ghép thay thế xương trong
điều trị viêm nha chu có tiêu xương theo chiều dọc……………………………………191.5. Biểu hiện dấu ấn sinh học trong dịch khe nướu khi sử dụng PRF trong điều
trị viêm nha chu có tiêu xương theo chiều dọc ………………………………………..22
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………….27
2.1. Nghiên cứu in vitro về hình thái và hóa sinh của A-PRF kết hợp vật liệu thay
thế xương dị loại …………………………………………………………………………………27
2.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu …………………………………………………..27
2.1.2. Dòng tế bào và dụng cụ, thiết bị, hóa chất nghiên cứu……………………….27
2.1.3. Tiến trình thực hiện nghiên cứu………………………………………………………29
2.1.4. Tổ chức nhóm nghiên cứu và kiểm soát sai lệch thông tin …………………37
2.1.5. Phương pháp phân tích số liệu………………………………………………………..38
2.1.6. Đạo đức trong nghiên cứu ……………………………………………………………..39
2.2. Nghiên cứu ứng dụng lâm sàng có nhóm chứng……………………………………..40
2.2.1. Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu …………………………………….40
2.2.2. Mẫu nghiên cứu ……………………………………………………………………………40
2.2.3. Phương tiện nghiên cứu…………………………………………………………………42
2.2.4. Quy trình nghiên cứu …………………………………………………………………….44
2.2.5. Mô tả các biến số nghiên cứu …………………………………………………………48
2.2.6. Tổ chức nhóm nghiên cứu và kiểm soát sai lệch thông tin …………………54
2.2.7. Phương pháp phân tích số liệu………………………………………………………..56
2.2.8. Đạo đức trong nghiên cứu ……………………………………………………………..57
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………………..58
3.1. Định lượng các yếu tố tăng trưởng PDGF-AB và VEGF phóng thích từ hỗn
hợp dịch chiết A-PRF-XBSM……………………………………………………………….58
3.1.1. Sự phóng thích yếu tố tăng trưởng PDGF-AB ở từng thời điểm thực
nghiệm và tích luỹ theo thời gian …………………………………………………………….58
3.1.2. Sự phóng thích yếu tố tăng trưởng VEGF ở từng thời điểm thực nghiệm
và tích luỹ theo thời gian ………………………………………………………………………..623.2. Tính an toàn và tác động của hỗn hợp A-PRF-XBSM đối với hPDLSCs …..67
3.2.1. Ảnh hưởng của A-PRF kết hợp XBSM lên khả năng sống của hPDLSCs
……………………………………………………………………………………………………………67
3.2.2. Tác động của A-PRF-XBSM lên sự tăng sinh của hPDLSCs……………..69
3.3. Hiệu quả lâm sàng và X quang của A-PRF kết hợp vật liệu thay thế xương dị
loại…………………………………………………………………………………………………….74
3.3.1. Tình trạng nha chu lúc ban đầu (T0) trên lâm sàng và phim X quang…..74
3.3.2. So sánh thay đổi chỉ số mảng bám (PlI) sau 3 và 6 tháng …………………..75
3.3.3. So sánh thay đổi chỉ số nướu (GI) sau 3 và 6 tháng …………………………..76
3.3.4. So sánh thay đổi vị trị bờ nướu (sự tụt nướu – GR) sau 3 và 6 tháng……77
3.3.5. So sánh thay đổi độ sâu túi nha chu (PD) sau 3 và 6 tháng…………………78
3.3.6. So sánh thay đổi về mất bám dính lâm sàng (CAL) sau 3 và 6 tháng…..79
3.3.7. So sánh tiêu mào xương ổ (ACR) trên X quang lúc ban đầu và 6 tháng 80
3.3.8. So sánh lấp khiếm khuyết (DF) trên X quang sau 6 tháng ………………….80
3.4. Mức độ hiện diện những yếu tố tăng trưởng PDGF-BB, VEGF và TGF-β1
trong dịch khe nướu (GCF)…………………………………………………………………..82
3.4.1. Biểu hiện PDGF-BB trong dịch khe nướu………………………………………..82
3.4.2. Biểu hiện VEGF trong dịch khe nướu ……………………………………………..83
3.4.3. Biểu hiện TGF-β1 trong dịch khe nướu …………………………………………..85
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN …………………………………………………………………………..88
4.1. Hiệu quả phóng thích yếu tố tăng trưởng PDGF-AB và VEGF trong dịch
chiết hỗn hợp A-PRF-XBSM………………………………………………………………..88
4.2. Tính an toàn và tác động của hỗn hợp A-PRF-XBSM đối với hPDLSCs …..91
4.2.1. Chọn nguồn tế bào thực hiện thí nghiệm………………………………………….91
4.2.2. Ảnh hưởng của A-PRF kết hợp XBSM lên khả năng sống của hPDLSCs
……………………………………………………………………………………………………………92
4.2.3. Tác động của A-PRF-XBSM lên sự tăng sinh của hPDLSCs……………..944.2.4. Tác động của A-PRF-XBSM lên sự di cư của hPDLSCs …………………..96
4.3. Hiệu quả lâm sàng khi sử dụng A-PRF kết hợp vật liệu thay thế xương dị loại
trong điều trị viêm nha chu có tiêu xương theo chiều dọc…………………………99
4.3.1. Bàn luận về đối tượng, phương pháp nghiên cứu………………………………99
4.3.2. Hiệu quả lâm sàng của A-PRF-XBSM thông qua đánh giá các chỉ số nha
chu……………………………………………………………………………………………………. 104
4.3.3. Thay đổi các biến số ACR và DF trên X quang sau 6 tháng……………. 113
4.4. Mức độ hiện diện những yếu tố tăng trưởng PDGF-BB, VEGF và TGF-β1
trong dịch khe nướu (GCF)……………………………………………………………….. 118
4.4.1. Bàn luận về phương pháp nghiên cứu ………………………………………….. 118
4.4.2. Đánh giá sự hiện diện những yếu tố tăng trưởng PDGF-BB, VEGF và
TGF-β1 trong dịch khe nướu ……………………………………………………………….. 119
4.5. Ứng dụng của đề tài, điểm mới và điểm hạn chế …………………………………. 124
4.5.1. Ý nghĩa ứng dụng của đề tài ……………………………………………………….. 124
4.5.2. Những điểm mạnh và điểm mới của nghiên cứu……………………………. 125
4.5.3. Hạn chế của đề tài……………………………………………………………………… 126
KẾT LUẬN …………………………………………………………………………………………….. 127
KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………………………………. 129
CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Phân loại viêm nha chu theo AAP 2017…………………………………………….15
Bảng 1.2 Tóm tắt nghiên cứu biểu hiện dấu ấn sinh học trong GCF khi sử dụng PRF
trong điều trị VNC có IBD…………………………………………………………………………….24
Bảng 2.1 Mức độ gây độc tế bào theo ISO10993-5:2009…………………………………..33
Bảng 2.2 Danh sách các biến số nghiên cứu trong nghiên cứu in vitro………………..37
Bảng 2.3 Tiêu chuẩn chỉ số mảng bám theo Silness và Loe (1964) …………………….49
Bảng 2.4 Tiêu chuẩn chỉ số nướu theo Silness và Loe (1964)…………………………….49
Bảng 2.5 Danh sách các biến số nghiên cứu trong nghiên cứu lâm sàng ……………..53
Bảng 3.1 Định lượng yếu tố tăng trưởng PDGF-AB của dịch chiết hỗn hợp
A-PRF-XBSM ở từng thời điểm…………………………………………………………………….58
Bảng 3.2 So sánh sự phóng thích PDGF-AB của dịch chiết hỗn hợp A-PRF-XBSM
ở từng thời điểm …………………………………………………………………………………………..59
Bảng 3.3 Định lượng yếu tố tăng trưởng PDGF-AB của dịch chiết hỗn hợp
APRF-XBSM tích luỹ theo thời gian………………………………………………………………61
Bảng 3.4 Định lượng yếu tố tăng trưởng VEGF của các dịch chiết hỗn hợp
A-PRF-XBSM ở từng thời điểm…………………………………………………………………….62
Bảng 3.5 So sánh sự phóng thích VEGF của dịch chiết hỗn hợp A-PRF-XBSM ở
từng thời điểm ……………………………………………………………………………………………..63
Bảng 3.6 Định lượng yếu tố tăng trưởng VEGF của dịch chiết hỗn hợp
APRF-XBSM tích luỹ theo thời gian………………………………………………………………65
Bảng 3.7 Phần trăm tỷ lệ tăng trưởng tương đối (RGR) ở các nghiệm thức …………69
Bảng 3.8 Số lượng hPDLSCs ở các nhóm tại các thời điểm ………………………………70
Bảng 3.9 So sánh mức độ tăng sinh hPDLSCs trong thí nghiệm tăng sinh tế bào
giữa các nhóm tại cùng thời điểm …………………………………………………………………..71
Bảng 3.10 Phần trăm diện tích vùng vô bào của các nhóm lúc 24 giờ …………………73
Bảng 3.11 Tình trạng nha chu lúc ban đầu trên lâm sàng và X quang …………………74
Bảng 3.12 So sánh thay đổi chỉ số PlI lúc ban đầu, sau 3 và 6 tháng …………………..75Bảng 3.13 So sánh thay đổi chỉ số GI lúc ban đầu, sau 3 và 6 tháng …………………..76
Bảng 3.14 So sánh thay đổi vị trí bờ nướu (tụt nướu) sau 3 và 6 tháng ……………….77
Bảng 3.15 So sánh thay đổi PD sau 3 và 6 tháng………………………………………………78
Bảng 3.16 So sánh thay đổi CAL sau 3 và 6 tháng……………………………………………79
Bảng 3.17 So sánh tiêu mào xương ổ (ACR) sau 6 tháng ………………………………….80
Bảng 3.18 So sánh lấp khiếm khuyết (DF) sau 6 tháng……………………………………..81
Bảng 3.19 So sánh tỷ lệ phần trăm lấp khiếm khuyết (DF) sau 6 tháng……………….81
Bảng 3.20 Nồng độ yếu tố tăng trưởng PDGF-BB (pg/mL) ở hai nhóm trong dịch
khe nướu tại các mốc thời gian ………………………………………………………………………82
Bảng 3.21 Nồng độ yếu tố tăng trưởng VEGF (pg/mL) trong dịch khe nướu tại các
mốc thời gian……………………………………………………………………………………………….84
Bảng 3.22 Nồng độ yếu tố tăng trưởng TGF-1 (pg/mL) trong dịch khe nướu tại các
mốc thời gian……………………………………………………………………………………………….85
Bảng 4.1 Tổng hợp và so sánh kết quả của nghiên cứu này với một số nghiên cứu
tương tự …………………………………………………………………………………………………… 122DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1 Nồng độ PDGF-AB tại mỗi thời điểm……………………………………………60
Biểu đồ 3.2 Nồng độ PDGF-AB tích luỹ qua các mốc thời gian…………………………62
Biểu đồ 3.3 So sánh nồng độ VEGF qua các mốc thời gian……………………………….64
Biểu đồ 3.4 So sánh nồng độ VEGF-AB tích luỹ qua các mốc thời gian……………..66
Biểu đồ 3.5 Xu hướng tăng sinh tế bào tại các thời điểm…………………………………..69
Biểu đồ 3.6 Sự thay đổi diện tích vùng vô bào sau 24 giờ …………………………………72
Biểu đồ 3.7 Xu hướng phóng thích GFs PDGF-BB trong dịch khe nướu tại các mốc
thời gian………………………………………………………………………………………………………83
Biểu đồ 3.8 Xu hướng phóng thích yếu tố tăng trưởng VEGF trong dịch khe nướu
tại các mốc thời gian …………………………………………………………………………………….85
Biểu đồ 3.9 Xu hướng phóng thích TGF-1 trong dịch khe nướu tại các mốc thời
gian…………………………………………………………………………………………………………….86DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Sự hiện diện GFs từ PRF ở các giai đoạn của quá trình lành thương……….5
Hình 1.2 Quy trình tạo PRF theo Choukroun …………………………………………………….7
Hình 1.3 Phân loại vách xương; A: 3 vách, B: 2 vách, C: 1 vách D: phối hợp ……..16
Hình 2.1 Fibrin giàu tiểu cầu cải tiến (A-PRF)…………………………………………………28
Hình 2.2 Vật liệu thay thế xương dị loại Bio-Oss……………………………………………..29
Hình 2.3 Cách đếm số lượng tế bào ………………………………………………………………..30
Hình 2.4 Các phương tiện nghiên cứu (A → E) ……………………………………………….43
Hình 2.5 Vật liệu ghép Bio-Oss ……………………………………………………………………..43
Hình 2.6 Màng collagen Bio-Gide………………………………………………………………….44
Hình 2.7 Quy trình lấy máu và ly tâm……………………………………………………………..44
Hình 2.8 Khối A-PRF sau khi ly tâm………………………………………………………………44
Hình 2.9 Khuôn ép, khối và màng A-PRF……………………………………………………….45
Hình 2.10 A-PRF được cắt thành từng mảnh nhỏ trộn với XBSM ……………………..45
Hình 2.11 Cách xác định các thông số trên lâm sàng qua Stent ………………………….45
Hình 2.12 Các giai đoạn phẫu thuật (A → E)…………………………………………………..46
Hình 2.13 Phương pháp thu thập dịch khe nướu trên lâm sàng và eppendorf chứa
băng giấy nha chu thấm dịch nướu và dung dịch đệm……………………………………….48
Hình 2.14 Tiêu chuẩn chỉ số mảng bám theo Silness và Loe (1964)……………………49
Hình 2.15 Tiêu chuẩn chỉ số nướu theo Silness và Loe (1964) …………………………..50
Hình 2.16 Phương pháp đo các biến số trên phim X quang CBCT……………………..51
Hình 2.17 Minh họa mốc đo các biến số trên phim X quang ……………………………..51
Hình 3.1 Độc tính in vitro của hPDLSCs…………………………………………………………68
Hình 3.2 Sự di cư của hPDLSCs sau khi ủ 24 giờ trong các môi trường ……………..72
Hình 4.1 Cây đo túi UNC-15 ……………………………………………………………………… 10