TÁCH CHIẾT ADN TỪ MÁU NGOẠI VI/ MÁU CUỐNG RỐN

DNA ISOLATION FROM PERIPHERAL BLOOD CELLS

 

NGUYÊN LÝ

Các tế bào có nhân đều chứa ADN – vật chất di truyền của toàn bộ cơ thể. ADN nằm trên nhiễm sắc thể bên trong nhân tế bào. Để tách được ADN người ta thường sử dụng các chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân, kết hợp với sử dụng các chất biến tính mạnh để loại bỏ các protein sau đó sử dụng cồn 96^o kết hợp với điều kiện nhiệt độ thấp để thu được ADN một cách tinh sạch và nguyên vẹn.

CHỈ ĐỊNH

Sử dụng cho tất cả người bệnh có chỉ định làm xét nghiệm PCR.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên xét nghiệm Sinh học phân tử đã được đào tạo.

Phương tiện – Hóa chất

Phương tiện

Buồng vô trùng (biology cabinet);

Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);

Máy vortex;

Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;

Đầu côn có màng lọc;

Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;

Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;

Tủ lạnh 4 – 8⁰C, tủ âm sâu – 20⁰C;

Găng tay.

Hóa chất

Sử dụng kit tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ADN như proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.

Bệnh phẩm

2ml máu ngoại vi/máu cuống rốn chống đông bằng EDTA.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

2ml máu ngoại vi/máu cuống rốn chống đông bằng EDTA.

Tiến hành kỹ thuật

Phương pháp tách chiết ADN cơ bản bao gồm các giai đoạn chính sau:

Phá màng tế bào và màng nhân:

Bệnh phẩm được ủ trong một dung dịch gồm chất tẩy mạnh (như SDS, sarcosyl) và enzym phân hủy protein (proteinaza K). Mục tiêu của bước ủ này là để phá màng tế bào và màng nhân đồng thời để ức chế hoạt động của các enzym ADNaza nội bào và tách protein ra khỏi các phân tử ADN.

Loại bỏ các protein:

Sử dụng dung dịch phenol/chloroform để biến tính protein, làm cho protein tạo thành một lớp tủa rõ rệt sau khi ly tâm, dễ dàng loại bỏ khỏi hỗn dịch.

Kết tủa ADN:

Sử dụng cồn để tủa ADN trong điều kiện lạnh và thu nhận lại ADN bằng ly tâm. ADN cần phải hòa lại trong nước khử enzym nucleaza.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Sử dụng 5µl ADN thu được để điện di kiểm tra trên gel agarose 0,5 – 0,8%, đồng thời đo độ sạch bằng quang phổ (A260/A280). Chất lượng ADN tốt nếu chỉ xuất hiện một băng có kích thức lớn >10 kb và tinh sạch nếu A260/A280 trong khoảng 1,8 – 2,0.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

SAI SÓT	XỬ TRÍ
Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông.	Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.
Thao tác pipet không chính xác.	Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.	Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất Thực hiện đúng, đủ các bước trong quy trình xét nghiệm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997). Các phương pháp tách chiết axit nucleic. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục, trang 124 – 125.

A.Rolfs et at (1992). PCR: Clinical Diagnosis and Research. Springer Verlag, Berlin.