Tách dòng, biểu hiện gen mã hóa Protein p24 của HIV-1 phân typ CRF01_ae và ứng dụng Protein tái tổ hợp phát hiện kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân
Đại dịch HIV (human immunodeficiency virus) ngày một lan rộng trên toàn cầu với tốc độ 13.000 ca nhiễm mới mỗi ngày, điều đó cũng có nghĩa là cứ mỗi phút có 9,3 trường hợp nhiễm mới và 5,9 trường hợp chết vì AIDS hoặc cứ 6-7 giây có một trường hợp nhiễm mới và cứ 10 giây có một người chết vì AISD trên thế giới [1]. Việt Nam là nước có tỷ lệ nhiễm HIV cao thứ 6 ở Châu Á. Để giảm thiểu sự lây lan của HIV/AIDS, việc phát hiện nhanh, sớm và chính xác nguồn bệnh để có biện pháp dự phòng và điều trị là việc làm hết sức cần thiết. Về lý thuyết người ta có thể phát hiện tất cả các kháng nguyên của virus nhưng trên thực tế, do tính đặc hiệu và ái lực của các kháng thể chủ yếu hướng tới các protein chính trong vỏ nhân như p24, vì vậy kháng nguyên p24 luôn được chọn để thực hiện chẩn đoán [3]. P24 tham gia vào quá trình ‘’cởi áo’’ sau khi virus xâm nhập vào tế bào đồng thời cũng tham gia vào quá trình sao chép ngược của virus. Kiểm tra kháng thể đặc hiệu của HIV được coi là dấu chuẩn của quá trình lây nhiễm [6]. Đối với HIV-1, phân type lưu hành chủ yếu tại Việt Nam là phân type CRF01_AE. Kit chẩn đoán trên cơ sở các protein tái tổ hợp biểu hiện từ phân typ lưu hành ở Việt Nam có thể sẽ cho kết quả đặc hiệu và chính xác hơn. Mục tiêu đề tài: Tách dòng và biểu hiện gen p24 thuộc phân typ CRF01_AE, thu nhận protein p24 tái tổ hợp phục vụ chế tạo kit chẩn đoán HIV ở Việt Nam.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Vật liệu
Mẫu máu của bệnh nhân nhiễm HIV được cung cấp bởi Viện vệ sinh phòng dịch quân đội, viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, bệnh viện đa khoa Quảng Ninh và Trung tâm cai nghiện Hải Phòng.
2. Phương pháp
Máu toàn phần của bệnh nhân nhiễm HIV được tiến hành tách chiết DNA tổng số. DNA tổng số được sử dụng làm khuôn để khuếch đại gen p24 bằng phương pháp PCR lồng. Xác định trình tự gen được tiến hành theo phương pháp của Sanger trên máy phân tích trình tự ABI PRISM®3100 Genetic Analyzer và phần mềm xử lý dữ liệu PC/GENE. Gen p24 được gắn vào hệ vectơ biểu hiện pET32a(+) thông qua hai vị trí của enzym giới hạn BamHI và XhoI để biểu hiện ra protein tái tổ hợp dạng liên kết Trx-p24-6His. Vectơ tái tổ hợp được biến nạp và biểu hiện trong tế bào E. coli chủng BL21-DE3 star. Protein p24 tái tổ hợp được tinh chế bằng cột ProBond Nickel- Chelating Resin sau đó kiểm tra bằng phản ứng western blot với kháng thể 1 là huyết thanh bệnh nhân dương tính HIV được pha
Đường chạy 1: Thang DNA chuẩn.
Đường chạy 2, 3: Sản phẩm PCR vòng 2
Thông tin này hy vọng sẽ gợi mở cho các bạn hướng tìm kiếm và nghiên cứu hữu ích