Tạo và tinh chế kháng thể kháng Heparansulphate Interacting Protein người (HHIP) từ thỏ

 

Heparansulphate Interacting Protein người (hHIP) tham gia điều hoà nhiều quá trình sống của tế bào thông qua sự tương tác với các yếu tố trong khoảng gian bào như các protease, yếu tố phát triển… Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy có sự tăng tổng hợp hHIP ở một số dòng tế bào và mô ung thư, đặc biệt ở các dòng tế bào ung thư biểu mô ác tính; không phát hiện thấy hHIP hoặc phát hiện mức độ rất thấp ở dòng tế bào sợi và tổ chức liên kết… Mức độ tổng  hợp hHIP phụ thuộc vào mức độ biệt hoá của các dòng tế bào ung thư. Kết quả nghiên cứu gần đây của chúng tôi đã chứng minh rằng mRNA của hHIP tăng cường sao chép ở các dòng tế bào và mô ung thư đại tràng, ung thư tuyến giáp, ung thư vú và ung thư tiền liệt tuyến [2, 4, 6]. Từ những kết quả đó, một câu hỏi đặt ra: Liệu mức độ tổng hợp protein hHIP luôn đi kèm với mức độ sao chép mRNA của hHIP và phụ thuộc vào quá trình bệnh lý  ung thư? Để trả lời

 

 

câu hỏi này việc đánh giá mức độ sinh tổng hợp protein hHIP bằng các kỹ thuật đặc hiệu sử dụng kháng thể kháng hHIP người là hết sức cần thiết. Chính vì vậy, đề tài này được tiến hành nhằm mục tiêu:

 

 

 

 

1. Gắn kết phân đoạn hHIP với protein mang, tạo ra kháng thể kháng hHIP người trên thỏ.

 

 

 

 

2. Tinh chế kháng thể kháng hHIP và  bước đầu đánh giá sơ bộ hiệu giá kháng thể thu được.

 

 

 

 

I. NGUYÊN  LIỆU  VÀ  PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

 

 

 

 

1. Nguyên liệu nghiên cứu

 

 

 

 

– 09 thỏ trưởng thành, khoẻ mạnh, trọng lượng 2,0 – 2,5 kg.

 

 

 

 

– Phân đoạn hHIP “AKAKA peptide”, 16 amino acids: 120 – 133:  CRPKAKAKAKAKDQTK nhận được từ GS. Alfredo Fusco (Đại học Naples, Italy). Các hoá chất khác được mua từ Sigma, Pierce với độ tinh khiết cao.

 

 

 

 

2. Phương pháp nghiên cứu

 

 

 

 

2.1. Gắn hHIP với protein mang Keyhole Lim- pet Hemocyanin (KLH) [7]

 

 

 

 

– Tạo 10mg/ml KLH trong nước cất.

 

 

 

 

– Hoà tan hHIP vào dung dịch đệm liên kết với thể tích gấp 1,0 – 2,5 thể tích dung dịch  KLH tương ứng sau đó trộn đều để hHIP gắn  với  KLH trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.

 

 

 

 

– Tinh chế phức hợp hHIP-KLH bằng sắc  ký lọc gel.

 

 

 

 

Mẫn cảm cho thỏ để tạo kháng  huyết thanh thỏ kháng hHIP

 

 

 

 

Gây miễn dịch cho thỏ 04 lần, mỗi lần 200μg phức  hợp  hHIP-KLH  cùng  với  800μl  tá   chất Freund, tiêm dưới  da. Ba lần đầu, mỗi lần cách nhau 01 tuần, lần thứ tư cách lần thứ nhất 01 tháng. Trong đó, lần tiêm thứ nhất và thứ ba dùng conjugate với tá chất Freund hoàn toàn; lần tiêm thứ hai và thứ tư với tá  chất Freund không hoàn toàn [1, 3]. Sau 09 ngày kể từ lần gây miễn dịch cuối cùng lấy máu thỏ qua động mạch cảnh. Ly tâm, tách huyết thanh. Huyết thanh được đông khô và cất giữ ở -200C.

 

 

 

 

Huyết thanh thỏ kháng hHIP được kiểm tra sơ bộ bằng kỹ thuật miễn dịch khuếch tán kép Ouchterlony.

 

 

 

 

Tinh chế Ig từ huyết thanh thỏ

 

 

 

 

Được tiến hành bằng phương pháp kết tủa với amonisulphate (NH4)2SO4 và đưa qua cột sắc ký ái lực Protein A-Sepharose [3]. Các bước tiến hành như sau:

 

 

 

 

– Pha loãng 5 ml huyết thanh thỏ + 5 ml đệm gắn, khuấy từ  ở 40C. Sau đó bổ sung từ từ 2,77g amonisulphate vào huyết thanh để  đạt  nồng độ 45% bão hoà. Khuấy từ ở nhiệt độ 40C/30 phút.

 

 

 

 

– Ly tâm 10.000 v/phút x 10 phút ở 40C. Cặn ly tâm được thu hồi và hoà tan trong 4 ml đệm gắn và thẩm tích qua đêm ở 40C trong 1lít đệm gắn, có  khuấy  từ.  Dịch  đã  thẩm  tích  được  ly  tâm 10.000v/phút x 10 phút ở 40C, loại bỏ cặn.

 

 

 

 

– Dịch đã thẩm tích được cho chảy qua cột sắc ký ái lực protein A sepharose. Cột được rửa bằng 80 ml đệm gắn cho đến khi OD ở 208nm về O. Sau đó các kháng thể được đẩy ra khỏi cột bằng dung dịch đệm glycin 0,1M pH 2,7.  Thu 10 ml dịch đầu tiên vào 10 ống, mỗi ống 1 ml. Thêm 1 ml Tris HCl 1M, pH 9 vào 10 ml dung dịch chứa IgG trên và được bảo quản ở 2 – 80C.

 

 

 

 

Dung dịch kháng thể được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide và xác định nồng độ IgG bằng phương pháp Bradford.