Thích nghi chủng sản xuất Vaccine dại Vnukovo – 32 trên tế bào Vero

Bệnh dại là bệnh viêm não tuỷ do virus dại gây nên, tỷ lệ tử vong gần như 100%, tuy vậy bệnh có thể phòng và điều trị dự phòng bằng vaccine hoặc phối hợp vaccine với huyết thanh kháng dại. Vaccine dại tế bào đã được chứng minh có độ an toàn và khả năng bảo vệ cao được TCYTTG khuyên dùng. Để tiến tới sản xuất vaccine dại tế bào trong nước, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với mục tiêu:

Thích nghi chủng sản xuất vaccine dại Vnukovo – 32 trên tế bào Vero nhằm tạo chủng gốc (MSV) và chủng sản xuất (WSV); kiểm tra chất lượng chủng giống.

I. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Vật liệu

– Chủng sản xuất vaccine dại Vnukovo – 32 (Viện Bại liệt và Viêm não Mosco); tế bào Vero (TCYTTG – ECACC); tế bào CER, BHK, Na2  (Nhật Bản); MEM (Gibco); DMEM (Gibco); Trypsine (Gibco), môi trường cất giữ tế bào (Gibco); kháng thể đơn dòng (mab) kháng N virus dại gắn FITC (Mab – FITC)

(Bio – rad), PCR mycoplasma kít (Bioscience); huyết thanh kháng dại (Pasteur Merieux).

– Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt, chuột  ổ, chuột lang (Cimade, viện VSDTTƯ).

2. Phương pháp nghiên cứu

Thích nghi chủng Vnukovo – 32  bằng phương pháp cấy truyền liên tiếp:

Cấy chủng Vnukovo – 32 trên tế bào Vero ở điều kiện tối ưu với nồng độ nuôi cấy (MOI) là 0,3; pH 7,4; nhiệt độ 37oC. Thu hoạch virus ở pha phát triển hàm số mũ [2], tiếp tục cấy truyền đến khi hiệu giá đạt 107LD50/ml (đời n) và ổn định hiệu giá ở hai đời cấy truyền tiếp theo. Sử dụng đời n làm chủng giống gốc (MSV), đời n+1 làm chủng giống sản xuất (WSV), đời n+2 là virus sản xuất vaccine.

Kiểm tra chất lượng chủng thích  nghi theo hướng dẫn sản xuất vaccine và  các chế phẩm sinh học của Hoa Kỳ và TCYTTG:

– Kiểm tra hiệu giá virus: sử dụng hai phương pháp trên tế bào và trên chuột

– Kiểm tra nhận dạng virus: phương pháp hiển vi điện tử nhuộm âm bản; lát cắt mỏng và miễn dịch huỳnh quang sử dụng kháng thể đơn dòng.

– Kiểm tra vô khuẩn

+ Kiểm tra vô khuẩn và vô nấm: bằng môi trường thioglycolate và soybean

+ Kiểm tra mycoplasma bằng kỹ thuật PCR.

– Kiểm tra virus ngoại lai:

+ Kiểm tra trên hệ thống tế bào: cấy truyền mù 3 đời WSV trên các dòng tế bào Vero, BHK, CER, NA2. Xác định hiện tượng huỷ hoại tế bào.

+ Kiểm tra trên mô hình động vật: Tiêm hỗn dịch WSV sau khi đã trung hoà với huyết thanh kháng dại cho chuột ổ và chuột 13 gam. Chuột đối chứng tiêm virus không được trung hoà. Quan sát hiện tượng bệnh lý của chuột sau 21 ngày.

+ Kiểm tra virus ngoại lai bằng phương pháp hiển vi điện tử: nhuộm âm bản và lát cắt mỏng.

– Kiểm tra khả năng sinh miễn dịch:

Gây miễn dịch cho chuột Swiss 3 tuần tuổi bằng hai mũi cơ bản chủng WSV sau khi bất hoạt bằng b propiolactone. Ngày thứ 14 sau khi tiêm mũi 2 lấy máu chuột định lượng kháng thể trung hoà bằng kỹ thuật RFFIT và ELISA.

– Kiểm tra độc lực trên mô hình động vật và tế bào:

+ Trên hệ thống tế bào: Gây nhiễm WSV trên các tế bào nhạy cảm với virus dại (CER, NA, BSR, Vero) theo dõi hiện tượng huỷ hoại tế bào. Chủng virus dại giảm độc lực không gây huỷ hoại tế bào.

+ Trên mô hình động vật: tiêm đường não WSV  cho  chuột  ổ  (0,01ml/con)  và  chuột  nhắt trắng 3 tuần tuổi (0,03ml/con). Theo dõi thời gian xuất hiện bệnh và các biểu hiện bệnh lý của chuột so với lô tiêm chủng gốc Vnukovo – 32.

– Phương pháp di truyền học: Giải trình tự gen P của hai chủng trước và sau thích nghi  bằng phương  pháp  cloning  gen  P.  So  sánh  trình  tự nucleotide và acid amine.

Để tiến tới sản xuất vaccine dại tế bào trong nước thì vấn đề mấu chốt phải có chủng sản xuất có chất lượng cao. Mục tiêu: thích nghi chủng sản xuất vaccine dại Vnukovo – 32 trên tế bào Vero. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: thích nghi chủng virus bằng phương pháp cấy truyền liên tiếp. Kết quả, bàn luận: Chủng Vnukovo – V06 đã hoàn toàn thích nghi trên tế bào Vero ở đời cấy truyền thứ 6, có hiệu giá 10 – 7LD50/ml, đạt các tiêu chuẩn chủng sản xuất vaccine dại của TCYTTG về tính ổn định hiệu giá, vô khuẩn, không nhiễm mycoplasma, không nhiễm virus ngoại lai, giảm độc lực, cố định và khả năng sinh miễn dịch là 0,97IU/ml. Kết luận: chủng Vnukovo – V06 là chủng Vnukovo – 32 đã thích nghi trên tế bào Vero và đạt tiêu chuẩn chủng sản xuất vaccine dại trên tế bào Vero của TCYYTG.