Thiết kế vector biểu hiện yếu tố đông máu VIII tái tổ hợp ở người

Hemophilia A là  bệnh  rối  loạn  đông  máu  có căn nguyên di truyền do thiếu hụt hoặc bất thường chức năng của yếu tố đông máu VIII. Đây là bệnh di truyến  lặn  liên  quan đến  sự  đột  biến  gen mã hóa  yếu  tố  VIII nằm  tại  vùng  q28 trên  cánh  dài của nhiễm sắc thể giới tính X [4]. Theo ước tính của tổ chức hemophilia thế giới, hiện nay có khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia trong đó bệnh hemophilia A hơn chiếm tới 85%. Việc  chẩn  đoán  chính xác  và  điều  trị sớm  căn bệnh này có một ý nghĩa rất quan trọng nhằm hạn chế  tối  đa tình trạng  chảy  máu  cũng  như giảm thiểu  khả  năng  trở  thành  tàn  tật.  Phương pháp điều trị bệnh hemophili A hiện  nay chủ yếu dựa vào việc truyền máu toàn phần và các chế phẩm từ máu như huyết tương, huyết tương tươi đông lạnh, tủa lạnh hoặc cô đặc yếu tố VIII đã có hiệu quả nhất định trong việc cải thiện chức năng đông máu  cho bệnh  nhân.  Tuy nhiên,  các  sản  phẩm này  có  nhiều  nhược  điểm  như:  giá  thành  đắt, nguồn  cung hạn  hẹp,  thời gian bán  hủy  ngắn  và đặc biệt khi sử dụng các sản phẩm này bệnh nhân có nguy cơ tiềm ẩn mắc các bệnh lây nhiễm qua đường truyền máu như HIV, HBV, HCV. Để khắc phục những nhược điểm đó các nhà khoa học đã thành  công  trong việc  áp  dụng  công  nghệ  gen hiện đại để tạo ra yếu tố VIII tái tổ hợp ứng dụng trong trong điều  trị với  ưu điểm  là  có  hàm  lượng cao, bảo  quản  dễ,  hiệu  quả rõ  rệt  và  không  chứa các yếu tố nguy cơ gây các bệnh truyền nhiễm theo đường máu. Thêm vào đó, việc điều trị thành công bệnh hemophilia trên mô hình động vật bằng liệu pháp gen đã đem lại những triển vọng đầy hứa hẹn trong việc điều trị tận gốc căn nguyên gây bệnh đối với các bệnh nhân hemophilia [3].
Ở Việt Nam, theo thống kê của viện Huyết học và Truyền máu Trung ương có khoảng hơn 5.000 bệnh  nhân  hemophilia nhưng chỉ mới  phát  hiện và điều trị được khoảng 20% các trường hợp [1]. Việc  áp  dụng  các  phương pháp  điều  trị  thông dụng hiện nay cũng không tránh khỏi những hạn chế như đã đề cập ở trên, đặc biệt là đối với các bệnh nhân Việt Nam vì giá thành của các chế phẩm đó thường quá đắt so với khả năng chi trả của  hầu  hết  bệnh  nhân.  Vì vậy  việc  sản  xuất  ra một  sản  phẩm  an toàn,  hiệu  quả  trong điều  trị đồng thời phù hợp với điều kiện thực tế Việt Nam sẽ mang một ý nghĩa thiết thực trong việc mở rộng pham vi điều trị, nâng cao thể trang và giảm thiểu những hậu quả do bệnh tật mang lại đối với bệnh nhân.  Chúng  tôi  tiến  hành  nghiên  cứu  “Thiết  kế và biểu hiện vector mang gen mã hoá yếu tố đông máu VIII tái tổ hợp ở người” nhằm mục tiêu:
1.    Tạo ra vector tái tổ hợp chứa các đoạn gen chức năng quan trọng của yếu tố VIII.
2.    Biến nạp và biểu hiện thành công các đoạn gen đó trong tế bào vi khuẩn.

II.    NGUYÊN  LIỆU  VÀ  PHƯƠNG  PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Nguyên liệu nghiên cứu

–    Vector p.QE30 – UA – A1A2: mang gen mã hóa đoạn gen A1A2 và vector p.QE30 – UA – A3C2: Mang gen mã hóa đoạn gen A3C2 của yếu tố VIII [2].
–    Các loại hóa chất cần thiết khác được mua từ hãng QIAGEN, Hoa Kỳ.
2.    Phương pháp nghiên cứu
    Tách chiết DNA plasmid
Plasmid p.QE30 – UA – A1A2 và p.QE30 – UA
– A3C2 được  tách  chiết  theo quy trình chuẩn  sử dụng KIT QIAgenTMminiprep
    Đưa đoạn gen A1A2 vào vector p.QE30 – UA – A3C2
–    Dùng enzyme PmlI, EcoRV để cắt đoạn gen A1A2 từ plasmid pQE – 30UA – A1A2 và mở vòng vector p.QE30 – UA – A3C2.
–    Điện  di sản  phẩm  cắt  trên  gel agarose  1% cùng với thang marker chuẩn.
–    Tinh sạch  DNA từ  gel agarose sử  dụng  Kit QIAquick Gel Extraction.
–    Đưa đoạn  gen PmlI – A1A2 – EcoRV  vào vector biểu hiện pQE – 30UA – A3C2 đã mở vòng bằng enzym PmlI và EcoRV nhờ T4 – DNA ligase ở điều kiện 160C qua đêm.
–    Hỗn hợp phản ứng lai được biến nạp vào tế bào biểu hiện E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt.
–    Sự có mặt của đoạn gen A1A2 và A3C2 được kiểm tra bằng phương pháp PCR (sử dụng 2 căp mồi A1A2 – F: 5 – TGT AGC CAC GTG ATG CAA ATA G – 3và A3C2 – R: 5 – CAG TGG GTC GAC GTC AGT AGA GGT – 3), cắt enzym giới hạn. Các đoạn gen sẽ được phân tích tự động bằng máy đọc trình tự gen ABI 310 (310; Applied  Biosystem) và  được  so sánh với các trình tự chuẩn của ngân hàng gen.
Việc điều trị dự phòng thành công bệnh hemophilia A bằng yếu tố VIII tái tổ hợp và liệu pháp gen trên mô hình động vật đã mở ra một hướng nghiên cứu đầy hứa hẹn cho việc điều trị căn bệnh này. Mục tiêu: trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hai vector đã tách dòng yếu tố VIII p.QE30 – UA – A1A2 và p.QE30 – UA – A3C2 nhằm thiết kế vector biểu hiện mang đoạn A1A2A3C2 dưới sự điều khiển của promoter T5. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: đoạn gen A1C2 được cắt từ vector p.QE30 – UA – A1A2 bằng enzyme PmlI, EcoRV sau đó  được  biến  nạp  vào  vector pQE – 30UA – A3C2 đã  được  mở  vòng.  Kỹ thuật  PCR, cắt enzym giới hạn và đọc trình tự gen được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen này trong vector biểu hiện. Kết quả: chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện p.QE30 – UA – A1A2A3C2 mang đoạn gen A1A2A3C2 của yếu tố VIII.