Thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất, tinh chế từ cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam
Luận án tiến sĩ y học Thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất, tinh chế từ cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam.Trong “Chiến lƣợc quốc gia phát triển ngành Dƣợc Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” (đƣợc ban hành theo Quyết định số 68/QĐ-TTg ngày 10/01/2014 của Thủ tƣớng Chính phủ) có nêu rõ phát huy thế mạnh, tiềm năng của Việt Nam để phát triển sản xuất thuốc từ dƣợc liệu. Trong chiến lƣợc này, mục tiêu cụ thể đến năm 2020 là phấn đấu sản xuất đƣợc 20% nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất thuốc trong nƣớc, thuốc sản xuất trong nƣớc chiếm 80% tổng giá trị thuốc tiêu thụ trong năm, trong đó thuốc từ dƣợc liệu chiếm 30%. Đồng thời, các sản phẩm từ dƣợc liệu (cao chuẩn, bột nguyên liệu, chiết xuất các loại tinh dầu, các hoạt chất tinh khiết) là một trong 5 nhóm sản phẩm chủ lực cũng đƣợc đề cập trong chiến lƣợc này.
Dƣợc điển Việt Nam xuất bản lần thứ năm (năm 2017) có 372 chuyên luận về dƣợc liệu và thuốc từ dƣợc liệu, trong đó có 117 chuyên luận dùng chất chuẩn để định tính, định lƣợng thành phần hoạt chất có trong dƣợc liệu và các sản phẩm có chứa nó. Bên cạnh đó, tiêu chuẩn chất lƣợng của nhiều sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu chƣa xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính, định lƣợng các thành phần hoạt chất hoặc các chất đánh dấu, mà mới định tính so sánh với dƣợc liệu chuẩn và định lƣợng hỗn hợp toàn phần bằng các phƣơng pháp kém hoặc không đặc hiệu và không định lƣợng đƣợc các hợp chất chính, đặc trƣng, đƣợc coi là các hợp chất có hoạt tính sinh học do thiếu chất chuẩn đối chiếu. Do đó, việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu đƣợc chiết xuất từ dƣợc liệu ngày càng trở nên cần thiết đối với công tác đảm bảo chất lƣợng thuốc, từ giai đoạn lựa chọn nguyên liệu đầu vào, đến việc xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng, cũng nhƣ việc kiểm tra, giám sát chất lƣợng thuốc lƣu hành trên thị trƣờng của cơ quan quản lý.
Trƣớc yêu cầu ngày càng cao của công tác kiểm tra, giám sát chất lƣợng thuốc, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng và Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh hàng năm vẫn từng bƣớc thiết lập, mở rộng quỹ chất chuẩn (bao gồm cả dƣợc liệu chuẩn và chất chuẩn đƣợc chiết xuất, phân lập, tinh chế từ dƣợc liệu). Tuy nhiên cho đến thời điểm hiện tại, cả hai Viện mới thiết lập đƣợc khoảng 200 dƣợc liệu chuẩn và 50 chất chuẩn đƣợc chiết xuất, phân lập từ dƣợc liệu. Phần lớn những chất chuẩn khác cần thiết cho công tác kiểm tra, giám sát chất lƣợng dƣợc liệu, thuốc từ dƣợc liệu vẫn phải nhập từ nƣớc ngoài với chi phí cao, thời gian cung cấp tƣơng đối lâu và thủ tục nhập khẩu còn phức tạp.-2- Bảy lá một hoa (Paris polyphylla Sm.) là cây thuốc quý và hiếm ở Việt Nam. Với thành phần hóa học chính là saponin, Bảy lá một hoa đã đƣợc chứng minh có các tác dụng ức chế nhiều loại tế bào ung thƣ [27],[49],[110], kích thích miễn dịch [83], cầm máu [103], giảm đau, chống viêm [36], chữa rắn độc cắn [1].
Với những tác dụng và công dụng quý nhƣ trên, Dƣợc điển Trung Quốc năm 2015 đã sử dụng 4 chất là chonglou saponin I (polyphyllin D), chonglou saponin II (paris saponin II), chonglou saponin VI (paris saponin VI) và chonglou saponin VII (paris saponin VII) làm 4 chất đánh dấu để kiểm tra chất lƣợng của dƣợc liệu này. Tổng hàm lƣợng của 4 chất trên không đƣợc ít hơn 0,60% tính theo dƣợc liệu khô kiệt [82].
Ở Việt Nam, Bảy lá một hoa mới chỉ đƣợc dùng trong trong các bài thuốc dân gian mà chƣa đƣợc nghiên cứu một cách có hệ thống và bài bản cũng nhƣ chƣa xây dựng, thiết lập đƣợc các chất đánh dấu, các chất chuẩn để kiểm tra chất lƣợng của dƣợc liệu này và các sản phẩm có chứa nó. Vì vậy việc thiết lập các chất chuẩn đƣợc chiết xuất, phân lập và tinh chế từ cây Bảy lá một hoa là nhiệm vụ cần thiết để góp phần chủ động nguồn cung cấp chất đối chiếu phục vụ nhu cầu kiểm tra chất lƣợng của dƣợc liệu này và những sản phẩm có chứa nó, góp phần mở rộng quỹ chất chuẩn dùng trong ngành Kiểm nghiệm thuốc ở Việt Nam.
Xuất phát từ những lý do nêu trên, đề tài “Thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất, tinh chế từ cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam” đƣợc thực hiện với các mục tiêu là:
1. Phân lập và tinh chế một số hợp chất trong các bộ phận của cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam đủ tinh khiết để làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn.
2. Xây dựng phương pháp phân tích một số saponin phục vụ cho việc thiết lập các chất chuẩn và khảo sát hàm lượng của các hợp chất nghiên cứu có trong một số mẫu cây Bảy lá một hoa.
3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu và thiết lập chuẩn phòng thí nghiệm cho các nguyên liệu đã phân lập, tinh chế được
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1- TỔNG QUAN 3
1.1. CÂY BẢY LÁ MỘT HOA 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố 3
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật 4
1.1.1.2. Phân bố 5
1.1.2. Thành phần hóa học 5
1.1.2.1. Trên thế giới 5
1.1.2.2. Ở Việt Nam 19
1.1.3. Tác dụng sinh học 19
1.1.3.1. Tác dụng ức chế tế bào ung thư 19
1.1.3.2. Tác dụng điều hòa miễn dịch 23
1.1.3.3. Tác dụng cầm máu và tan máu 24
1.1.3.4. Tác dụng chống oxy hóa 25
1.1.3.5. Tác dụng kháng virus, kháng nấm và chống ký sinh trùng 25
1.1.3.6. Tác dụng trên thần kinh 26
1.1.3.7. Tác dụng trên dạ dày 27
1.1.4. Các phƣơng pháp định lƣợng saponin trong cây Bảy lá một hoa 27
1.1.4.1. Phương pháp HPLC 27
1.1.4.2. Phương pháp UV 29
1.1.4.3. Phương pháp ELISA 29
1.1.4.4. Phương pháp FT-IR 29Trang
1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHẤT NGHIÊN CỨU 29
1.2.1. Paris saponin H (Paris H) 29
1.2.2. Paris saponin II (Paris II) 30
1.2.3. Gracillin 30
1.2.4. Dioscin (Paris III) 31
1.2.5. Polyphyllin D (Paris I) 32
1.3. CHẤT CHUẨN 33
1.3.1. Khái niệm và vai trò của chất chuẩn 33
1.3.1.1. Khái niệm về chất chuẩn 33
1.3.1.2. Phân loại chất chuẩn 33
1.3.1.3. Vai trò của chất chuẩn 35
1.3.2. Quy trình thiết lập chất chuẩn 36
1.3.2.1. Tổng quan về hướng dẫn thiết lập chất chuẩn 36
1.3.2.2. Các bước để thiết lập chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu 36
Chƣơng 2-ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
41
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 41
2.2. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ 42
2.2.1. Chất chuẩn 42
2.2.2. Hóa chất, dung môi và thuốc thử 43
2.2.3. Trang thiết bị 43
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44
2.3.1. Phƣơng pháp chiết xuất 44
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập và tinh chế các hợp chất 44
2.3.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc của các hợp chất 44Trang
2.3.4. Phƣơng pháp kiểm tra và đánh giá hàm lƣợng nguyên liệu đểthiết lập chuẩn 44
2.3.4.1. Kiểm tra sơ bộ nguyên liệu thiết lập chuẩn 44
2.3.4.2. Đánh giá nguyên liệu thiết lập chuẩn 45
2.3.5. Xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng cho nguyên liệu thiết lập chuẩn 47
2.3.5.1. Yêu cầu kỹ thuật 47
2.3.5.2. Phương pháp thử 47
2.3.6. Thiết lập chất chuẩn 48
2.3.6.1. Đánh giá chất lượng nguyên liệu để thiết lập chuẩn 48
2.3.6.2. Đóng lọ 48
2.3.6.3. Đánh giá đồng nhất lô trong quá trình đóng gói 48
2.3.6.4. Xác định giá trị công bố trên chứng chỉ 49
2.3.6.5. Lập hồ sơ, chứng chỉ, dán nhãn 50
2.3.6.6. Đánh giá độ ổn định 50
2.3.7. Sơ bộ khảo sát hàm lƣợng của các hợp chất nghiên cứu có trong một số
mẫu cây và chế phẩm có chứa Bảy lá một hoa
50
2.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 50
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 51
3.1. CHỌN CÁC HỢP CHẤT ĐỂ THIẾT LẬP CHUẨN TỪ CÂY BẢY LÁ
MỘT HOA
51
3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích đồng thời 4 saponin có trong cây Bảy lá
một hoa
51
3.1.1.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký 51
3.1.1.2. Chuẩn bị mẫu thử 53
3.1.1.3. Thẩm định phương pháp định lượng 53
3.1.2. Sơ bộ xác định hàm lƣợng 4 saponin trong một số mẫu nghiên cứu 55
3.1.2.1. Hàm lượng 4 saponin có trong thân rễ mẫu PPC 01 55Trang
3.1.2.2. Hàm lượng 4 saponin trong thân rễ một số mẫu khác 55
3.1.2.3. Hàm lượng 4 saponin trong phần trên mặt đất 56
3.1.3. Chọn lựa hợp chất trong cây Bảy lá một hoa để thiết lập chuẩn 56
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG BẢY LÁ MỘT
HOA LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN
57
3.2.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc PS-H 57
3.2.1.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế 57
3.2.1.2. Định tính và xác định cấu trúc 58
3.2.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc gracillin 62
3.2.2.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế 62
3.2.2.2. Định tính và xác định cấu trúc 62
3.2.3. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc PS-II 65
3.2.3.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế 65
3.2.3.2. Định tính và xác định cấu trúc 67
3.2.4. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc của polyphyllin D 69
3.2.4.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế 71
3.2.4.2. Định tính và xác định cấu trúc 72
3.2.5. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc dioscin 76
3.2.5.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế 76
3.2.5.2. Định tính và xác định cấu trúc 76
3.3. KẾT QUẢ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN VÀ THIẾT LẬP CHUẨN TỪ
CÁC NGUYÊN LIỆU PHÂN LẬP ĐƢỢC
80
3.3.1. Xây dựng một số phƣơng pháp phục vụ cho thiết lập chuẩn 80
3.3.1.1. Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng các nguyên liệu 80
3.3.1.2. Xây dựng phương pháp xác định giới hạn tạp chất liên quan trong các
nguyên liệu
81Trang
3.3.2. Thiết lập chất chuẩn paris saponin H 83
3.3.2.1. Mục đích sử dụng 83
3.3.2.2. Tiêu chuẩn chất lượng 83
3.3.2.3. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn PS-H 86
3.3.2.4. Đóng gói 90
3.3.2.5. Đánh giá đồng nhất lô trong quá trình đóng gói 91
3.3.2.6. Đánh giá liên phòng thử nghiệm 91
3.3.2.7. Xác định giá trị công bố trên CoA 92
3.3.2.8. Đánh giá độ ổn định 92
3.3.3. Thiết lập chất chuẩn paris saponin II 93
3.3.3.1. Mục đích sử dụng 93
3.3.3.2. Tiêu chuẩn chất lượng 93
3.3.3.3. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn PS-II 96
3.3.3.4. Đóng gói 100
3.3.3.5. Đánh giá đồng nhất lô trong quá trình đóng gói 100
3.3.3.6. Đánh giá liên phòng thử nghiệm 100
3.3.3.7. Xác định giá trị công bố trên CoA 101
3.3.3.8. Đánh giá độ ổn định 101
3.3.4. Thiết lập chất chuẩn gracillin 102
3.3.4.1. Mục đích sử dụng 102
3.3.4.2. Tiêu chuẩn chất lượng 102
3.3.4.3. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn gracillin 105
3.3.4.4. Đóng gói 109
3.3.4.5. Đánh giá đồng nhất lô trong quá trình đóng gói 109
3.3.4.6. Đánh giá liên phòng thử nghiệm 109Trang
3.3.4.7. Xác định giá trị công bố trên CoA 110
3.3.4.8. Đánh giá độ ổn định 111
3.3.5. Thiết lập chất chuẩn polyphyllin D 112
3.3.5.1. Mục đích sử dụng 112
3.3.5.2. Tiêu chuẩn chất lượng 112
3.3.5.3. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn polyphyllin D 114
3.3.5.4. Đóng gói 118
3.3.5.5. Đánh giá đồng nhất lô trong quá trình đóng gói 118
3.3.5.6. Đánh giá liên phòng thử nghiệm 119
3.3.5.7. Xác định giá trị công bố trên CoA 119
3.3.6. Thiết lập chất chuẩn dioscin 120
3.3.6.1. Mục đích sử dụng 120
3.3.6.2. Tiêu chuẩn chất lượng 120
3.3.6.3. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn dioscin 123
3.3.6.4. Đóng gói 126
3.3.6.5. Đánh giá đồng nhất lô trong quá trình đóng gói 127
3.3.6.6. Đánh giá liên phòng thử nghiệm 127
3.3.6.7. Xác định giá trị công bố trên CoA 127
3.7. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MỘT SỐ SAPONIN TRONG CÂY BẢY LÁ
MỘT HOA VÀ CHẾ PHẨM
128
Chƣơng 4. BÀN LUẬN 135
4.1. VỀ CHỌN HỢP CHẤT VÀ PHÂN LẬP, TINH CHẾ ĐỂ LÀM
NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN
135
4.1.1. Chọn hợp chất trong cây Bảy lá một hoa cần phân lập 135
4.1.2. Về chiết xuất và phân lập các hợp chất 137
4.2. VỀ XÂY DỰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC SAPONIN 138Trang
4.2.1. Phân tích đồng thời 4 chất paris saponin VII, paris saponin VI, paris
saponin II và polyphyllin D (Phƣơng pháp 1)
138
4.2.2. Phân tích đồng thời 3 chất paris saponin H, paris saponin II và gracillin
(Phƣơng pháp 2)
139
4.2.3. Phân tích polyphyllin D và dioscin (Phƣơng pháp 3) 140
4.2.4. Phân tích đồng thời 8 saponin (Phƣơng pháp 4) 140
4.2.5. Các điều kiện sắc ký chung và các chỉ tiêu thẩm định phƣơng pháp 141
4.2.5.1. Thẩm định quy trình định tính, định lượng 141
4.2.5.2. Thẩm định quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan 142
4.3. VỀ THIẾT LẬP CÁC CHẤT CHUẨN 142
4.3.1. Xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng 142
4.3.2. Kiểm tra chất lƣợng nguyên liệu thiết lập chuẩn 143
4.3.3. Đóng gói và theo dõi độ ổn định 143
4.3.4. Kết quả thiết lập chất chuẩn 144
4.4. VỀ ỨNG DỤNG CÁC CHẤT CHUẨN THIẾT LẬP ĐƢỢC 144
4.5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 146
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 147
KẾT LUẬN 147
KIẾN NGHỊ 148
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN
149
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CÁC PHỤ LỤc
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
PHỤ LỤC TÊN PHỤ LỤC Trang
Phụ lục 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời một
số saponin trong dược liệu bảy lá một hoa ở Việt Nam bằng
phương pháp HPLC
PL1
Phụ lục 2. Xây dựng quy trình định lượng paris saponin H (paris H), paris
saponin II (paris II) và gracillin chiết xuất, phân lập từ cây bảy lá
một hoa ở Việt Nam bằng kỹ thuật HPLC
PL31
Phụ lục 3. Thẩm định quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan trong
nguyên liệu paris saponin H bằng phương pháp HPLC
PL58
Phụ lục 4. Thẩm định quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan trong
nguyên liệu paris saponin II bằng phương pháp HPLC
PL72
Phụ lục 5. Thẩm định quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan trong
nguyên liệu gracillin bằng phương pháp HPLC
PL86
Phụ lục 6. Thẩm định quy trình định tính, định lượng và xác định giới hạn
tạp chất liên quan trong nguyên liệu dioscin bằng phương pháp
HPLC
PL100
Phụ lục 7. Thẩm định quy trình định tính, định lượng và xác định giới hạn
tạp chất liên quan trong nguyên liệu polyphyllin D bằng phương
pháp HPLC
PL146
Phụ lục 8. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng
thời các chất paris saponin VII, paris saponin D, paris saponin H,
paris saponin VI, paris saponin II, dioscin, gracillin và
polyphyllin D bằng phương pháp HPLC
PL191
Phụ lục 9. Dữ liệu đo phổ của paris saponin H PL235
Phụ lục 10. Dữ liệu đo phổ của paris saponin II PL239
Phụ lục 11. Dữ liệu đo phổ của gracillin PL243
Phụ lục 12. Dữ liệu đo phổ của polyphyllin D PL247
Phụ lục 13. Dữ liệu đo phổ của dioscin PL269
Phụ lục 14. Kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy PL2