Thiết lập quy trình xây dựng bộ RNA chuẩn cho xét nghiệm real-time RT-PCR phát hiện vi rút Dengue

Thiết lập quy trình xây dựng bộ RNA chuẩn cho xét nghiệm real-time RT-PCR phát hiện vi rút Dengue
Tác giả: Phạm Thị Thu Hằng, Cao Minh Thắng, Vũ Thiên Thu Ngữ, Huỳnh Thị Kim Loan, Vũ Đình Luân, Huỳnh Phương Thảo, Bùi Chí Tâm và Vũ Thị Quế Hương
Tóm tắt:
Nghiên cứu này nhằm thiết lập quy trình xây dựng bộ RNA chuẩn để tạo nguồn vật liệu hỗ trợ hiệu quả cho hoạt động tối ưu hóa quy trình và xác nhận phương pháp xét nghiệm real-time RT-PCR trong chẩn đoán phát hiện sớm và định lượng DENV trong mẫu bệnh phẩm. Quy trình được thiết kế gồm 5 bước: (1) tạo nguồn bốn týp DENV (-1, -2, -3, -4) trên nuôi cấy tế bào, (2) thu thập DNA vùng C-prM của DENV bằng RT-PCR với bộ mồi Lanciotti, (3) tạo dòng T/A sử dụng E.coli JM109, tách chiết và tinh sạch plasmid tái tổ hợp của từng týp DENV, (4) xác định chiều và khuếch đại đoạn gen (T7-D1D2) trên plasmid, tinh sạch và phiên mã in vitro đoạn gen này, và (5) định lượng số copies RNA thu được của từng týp DENV bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 260nm. Mỗi bước quy trình đều được kiểm tra sản phẩm. Kết quả cho thấy DNA vùng gen C-prM của từng týp DENV được khuếch đại và tinh sạch, tạo dòng thành công các đoạn gen này trên dòng tế bào E.coli JM109. Bộ RNA chuẩn vùng C-prM từng týp DENV được thu thập với nồng độ xác định là 6.02E+12 copies (DENV-1), 5.73E+12 copies (DENV-2), 8.96E+12 copies (DENV-3), và 7.49E+12 copies (DENV-4). Quy trình xây dựng bộ RNA chuẩn đã được thiết lập thành công. Sản phẩm RNA thu được làm tiền đề cho việc tối ưu hóa quy trình xét nghiệm Real-time RT-PCR trong nghiên cứu và chẩn đoán bệnh SXHD.