Thử nghiệm chế phẩm tái tổ hợp định lượng kháng nguyên CD33 trong huyết tương bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy

Lơ xê mi cấp dòng tủy (Acute myelogenous leukemia, AML) là một trong những bệnh máu ác tính thường gặp ở người lớn. Ớ các nước phương Tây, AML chiếm khoảng 40% trong tong số các trường hợp lơ xê mi, trong đó ở người lớn chiếm khoảng 80% và ở trẻ em 15-21%.

Bệnh được đặc trưng bởi sự tăng sinh một loại tế bào non chưa biệt hóa hoặc biệt hóa rất ít có nguồn gốc là tế bào gốc định hướng dòng tủy, làm suy giảm quá trình tạo máu bình thường của cơ thể con người.

Tại Việt Nam, theo Trần Thị Minh Hương (2000) bệnh nhân lơ xê mi chiếm 78,2 % số bệnh nhân mắc bệnh máu nói chung, trong đó tỷ lệ lơ xê mi cấp dòng tủy chiếm 54,6% [11]. Theo Nguyễn Triệu Vân, trên 1118 bệnh nhân lơ xê mi từ năm 1996 – 2007 tại viện Huyết Học Truyền máu, lơ xê mi cấp dòng tủy chiếm 58,68% [34].

Việc chẩn đoán bệnh không chỉ dựa vào duy nhất các xét nghiệm huyết đồ, tủy đồ mà các kỹ thuật hóa học tế bào, kỹ thuật phân tích nhiễm sắc thể, kỹ thuật miễn dịch, kỹ thuật sinh học phân tử cũng giúp phân loại các nhóm và dưới nhóm của lơ xê mi cấp dòng tủy. Việc chan đoán phân loại chi tiết không chỉ giúp đánh giá tiên lượng bệnh mà còn giúp định hướng điều trị thích hợp.

Ớ các bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy, trên 90% tế bào non ác tính có biểu hiện kháng nguyên CD33 [130], [134]. CD33 đã được sử dụng trong bộ panel để chẩn đoán và phân loại dưới nhóm của lơ xê mi cấp dòng tủy [34]. Ớ Việt nam, các kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp hay đếm tế bào qua dòng chảy được dùng để xác định sự có mặt của CD33 trên bề mặt tế bào non ác tính, nhưng vẫn dừng ở mức độ xác định tỷ lệ tế bào non ác tính có sự biểu hiện CD33 trên tổng số bạch cầu có nhân trong mẫu tủy của các bệnh nhân này. Mặt khác, các kít dùng để phát hiện CD33 vẫn phải nhập ngoại. Kháng thể kháng CD33 đã được dùng trong điều trị hướng đích ở các bệnh nhân AML. Trong nghiên cứu này kháng thể kháng CD33 tái to hợp được sản xuất bởi phòng Công nghệ tế bào Động vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện khoa học Việt nam được sử dụng để định lượng nồng độ CD33 tự do trong huyết tương. Nồng độ CD33 tự do trong huyết tương sẻ thay đổi như thế nào trong quá trình điều trị AML, đặc biệt là trong điều trị hướng đích khi mà các cơ chế tác dụng của thuốc là thông qua sự kết hợp với kháng nguyên CD33 để tác dụng vào trong tế bào. Đề tài “Thử nghiệm chế phẩm tái tổ hợp định lượng kháng nguyên CD33 trong huyết tương bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy ” được thực hiện với mục tiêu sau:

1. Hoàn chỉnh kỹ thuật định lượng CD33 tự do trong huyết tương bằng kỹ thuật Phage Display Real time Immuno – PCR sử dụng kháng thể kháng CD33 tái tổ hợp của phòng Công nghệ tế bào Động vật, Viện Công nghệ Sinh học.

2. Theo dõi diễn biến nồng độ kháng nguyên CD33 tự do trong huyết tương các bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy trong quá trình điều trị.

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cám ơn

Lời cam đoan

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng, biểu đồ, đồ thị

Danh mục các hình vẽ, ảnh

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1. Lơ xê mi cấp dòng tuỷ 3

1.1.1. Bệnh nguyên và bệnh sinh 3

1.1.2. Triệu chứng lâm sàng 4

1.1.3. Các xét nghiệm huyết học 5

1.1.4. Tiêu chuẩn chẩn đoán 5

1.1.5. Các kỹ thuật sử dụng dùng để chẩn đoán AML 5

1.1.5.1. Các xét nghiệm hình thái và hoá học tế bào (HTH- 5

HHTB)

1.1.5.2. Phương pháp miễn dịch 7

1.1.5.3. Phương pháp di truyền tế bào học 9

1.1.5.4. Kỹ thuật sinh học phân tử 10

1.1.6. Phân loại AML 12

1.1.6.1. Phân loại theo FAB 12

1.1.6.2. Phân loại theo WHO 14

1.1.7. Điều trị 15

1.1.7.1. Điều trị hoá chất 15

1.1.7.2. Điều trị hướng đích 16

1.1.7.3. Ghép tế bào gốc 17

1.2. Kháng nguyên CD33 19

1.2.1. Cấu trúc và sự biểu hiện của CD33 20

1.2.2. Chức năng của CD33 21

1.3. Kháng thể đặc hiệu kháng CD33 21

1.3.1. Kháng thể đơn dòng 21

1.3.2. Các loại kháng thể đơn dòng 22

1.3.2.1, Phân tử kháng thể toàn vẹn 22

1.3.2.2, Kháng thể đơn chuỗi 24

1.3.2.3. Kháng thể phage – scFv 26

1.3.2.4. Kháng thể đơn dòng kháng CD33 sử dụng trong chẩn 28

đoán và điều trị AML

1.4. Kỹ thuật real time – PCR 33

1.5. Kỹ thuật Phage Display Real time Immuno – PCR 36

1.6. Các nghiên cứu về kháng nguyên và kháng thể kháng CD33 39

trong chẩn đoán và điều trị

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật định tính và định lượng CD33 trong 41

huyết tương

2.2. Định lượng kháng nguyên CD33 trong máu bệnh nhân AML 41

bằng kỹ thuật Phage Display Real time Immuno – PCR (PDRTI-PCR)

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 41

2.2.2. Đối tượng loại trừ 41

2.2.3. Tiêu chuẩn đánh giá kết quả điều trị 42

2.2.4. Phân nhóm đối tượng nghiên cứu 42

2.2.5. Phương pháp nghiên cứu 43

2.2.6. Các chỉ tiêu nghiên cứu 43

2.3. Vật liệu nghiên cứu và trang thiết bị 43

2.3.1. Vật liệu 43

2.3.2. Trang thiết bị 43

2.3.3. Hoá chất 44

2.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 44

2.4.1. Nhuộm peroxydase 44

2.4.2. Nhuộm Sudan đen 45

2.4.3. Nhuộm esterase không đặc hiệu 46

2.4.4. Kỹ thuật Phage Dislay Real time Immuno – CR (PDRTI – 47

PCR)

2.5. Thời gian và nơi tiến hành nghiên cứu 49

2.6. Đạo đứcy học 49

2.7. Quản lý thông tin và phân tích số liệu 49

2.8. Sơ đồ nghiên cứu 49

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50

3.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật định lượng CD33 trong HT bằng kỹ thuật 50

PDRTI-PCR và kỹ thuật bán định lượng ELISA

3.1.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật định lượng CD33 bằng kỹ thuật PDRTI- 51

PCR

3.1.1. Chọn cặp mồi thích hợp 51

3.1.2. Quy trình định lượng 52

3.1.3. Xây dựng đường chuẩn độ 54

3.1.4. Độ lặp lại kết quả CD33 tự do/HT của kỹ thuật PDRTI- 55

PCR

3.1.5. Xác định độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp PDRTI 55

-PCR trong việc định lượng nồng độ CD33 tự do /HT

3.2. Xác định nồng độ CD33 tự do/HT ở nhóm nghiên cứu 56

3.2.1. Nồng độ CD33 tự do/HT ở nhóm người bình thường 56

3.2.2. Nhóm bệnh nhân 57

3.2.2.1. Nhóm bệnh nhân mới phát hiện chưa điều trị 57

3.2.2.2. Nồng độ CD33tự do/HT và một số thông số huyết học ở 59

các bệnh nhân AML trước các đợt điều trị

3.2.2.3. Diễn biến giá trị trung bình nồng độ CD33 tự do/HT và 64

một số thông số huyết học ở bệnh nhân AML trong đợt

điều trị 1.

3.2.2.4. Diễn biến giá trị trung bình nồng độ CD33 tự do/HT và 67

một số thông số huyết học ở các bệnh nhân AML trong

đợt điều trị 2

3.2.2.5. Diễn biến giá trị trung bình nồng độ CD33 tự do/HT và 69 một số thông số huyết học ở các bệnh nhân AML trong

đợt điều trị 3

3.2.2.6. Diễn biến giá trị trung bình nồng độ CD33 tự do/HT và 71 một số thông số huyết học ở các bệnh nhân AML trong

đợt điều trị 4

3.2.3. Diễn biến nồng độ CD33 tự do/HT ở các bệnh nhân nghiên 73 cứu dọc qua 4 đợt điều trị

3.2.4. Diễn biến nồng độ CD33 tự do/HT ở các bệnh nhân nghiên 74

cứu dọc trong từng đợt điều trị

3.2.5. Sự thay đổi nồng độ CD33 tự do/HT liên quan đến kết quả 77

điều trị

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 80

4.1. Xây dựng kỹ thuật định lượng nồng độ CD33 tự do/HT bằng 80

*/ • o •/ « « # o o # # o

kỹ thuật Phage Display Real time Immuno – PCR (kỹ thuật PDRTI-PCR

4.1.1. Đánh giá đường chuẩn 80

4.1.2. Xác định độ nhạy độ đặc hiệu 81

4.2. Xác định nồng độ CD33 tự do/HT và các thông số huyết học 81

• o • • o «/ •

ở nhóm nghiên cứu

4.2.1. Đặc điểm nhóm bệnh nhân AML 82

4.2.1.1. Đặc điểm huyết học 83

4.2.1.2. Nồng độ CD33 tự do/HT ở các bệnh nhân mới phát 86

hiện bệnh chưa điều trị

4.2.1.3. Nồng độ CD33 tự do/HT và một số chỉ số huyết học ở 89

các bệnh nhân AML trước các đợt điều trị

4.2.1.4. Nồng độ CD33 tự do/HT và các thông số huyết học ở 89

các bệnh nhân AML trong các đợt điều trị

4.2.2. Sự thay đổi nồng độ CD33 tự do/HT liên quan đến kết quả 102

điều trị

KẾT LUẬN 105

KIẾN NGHỊ 106

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN 107

LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO 108