Thu nhận kháng nguyên ung thu phôi, Cyfra 21-1, bằng kỹ thuật gen

Ung thư là một thuật ngữ chung chỉ hơn 200 loại bệnh khác nhau gây ra bởi sự tăng sinh quá mức của các tế bào không bình thường. Sự tăng sinh này không tuân theo các cơ chế kiểm soát sinh trưởng của cơ thể. Đó là kết quả của hàng loạt các biến đổi bất thường trong cơ chế sinh sản của tế bào.
Theo nghiên cứu của Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (International Agency for Research on Cancer – IARC), đa số ung thư phổi xuất phát từ lớp biểu mô phế quản nên ƯTP còn được gọi là ung thư biểu mô phế quản. UTP thường được chia làm hai loại chính: UTP tế bào nhỏ (small-cell carcinoma hay SCC) và UTP tể bào không nhỏ (non small-cell carcinoma hay NSCC), tuỳ thuộc vào hình dạng tế bào dưới kính hiển vi. Mỗi loại ung thư phát triển và lan theo những cách khác nhau (1, 2, 3, 4).
UTP tế bào nhỏ (SCC) chiếm khoảng 20% trong số các bệnh UTP, loại này thường phát triển ở phế quản – phổi (không ở ngoại vi phoi). Mặc dù tế bào ung thư là những tế bào nhỏ, nhưng chúng phát triển rất nhanh tạo thành những khối u lớn, lan rất xa trước khi có triệu chứng lâm sàng, nhiều trường hợp khi phát hiện không còn mổ được nữa, tử vong nhanh. Đây là loại ung thư có quan hệ mật thiết nhất đối với thuốc lá và cũng là loại ung thư ác tính nhất.
UTP tế bào không nhỏ (NSCC) thường gặp hơn UTP tế bào nhỏ (khoảng 80%) và nó thường phát triển và lan chậm hơn và được đặt tên theo loại tế bào từ đó ung thư phát triển: Ung thư tế bấo tuyến (adenocarcinoma, AC): xuất phát từ tế bào tuyến nhầy trong thành phế quản, chiếm tỷ lệ khoảng 35-40% các loại UTP. Đây là dạng ƯTP phổ biến nhất ở phụ nữ và những người khống hút thuốc. Ung thư tế bào sừng (squamous-cell carcinoma; SCC): hay xuất hiện ơ phế quản lớn và làm chít hẹp lòng phế quản. Đây là dạng UTP phổ biến nhất ở nam giới, chiếm tỷ lệ khoảng 30-35% các loại ƯTP.Ung thư tế bào ỉớn (large-cell carcinoma; LCC): hình thành gần bề mặt phổi, chiếm tỷ lệ khoảng 10-15% các loại UTP (5, 6).
Hiện nay, trên thế giới tỷ lệ mắc ƯTP trong tổng số các bệnh ung thư khoảng 13%, nhưng đây lại là căn bệnh gây tử vong cao nhất trong số các bệnh ung thư, chiếm đến 31% số người chết hàng năm do ung thư. UTP là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở Mỹ, tốc độ tử vong cao (sau năm năm mắc UTP chỉ có 14% sống sót).
Ở nước ta, ƯTP là một căn bệnh khá phổ biến, chiếm tỷ lệ 5,9% các loại ung thư ở nam giới. ƯTP đứng hàng thứ 5 sau ung thư vòm họng (14%), ung thư dạ dày (12,8%), ung thư dương vật (10%) và ung thư gan (9,3%). Trong một cuộc điều tra 2 năm (1982-1983) tại 18 bệnh viện ở Hà Nội, Nguyễn Công Thụy và cộng sự (1987) đã thu thập được kết quả của 2253 bệnh nhân ung thư, trong đó, đứng hàng đầu là ung thư dạ dày (15,5%), sau đó là UTP (14%).
Ung thư phổi được chẩn đoán đựa vào các triệu chứng (Ho; ho ra máu; khò khè; hụt hơi; khó chịu trong lúc thở; đau ngực; có các triệu chứng của bệnh viêm phổi; khó chịu trong lúc nuốt; khàn giọng; sụt cân và chán ăn; ngoài ra, có thể có các triệu chứng do di căn, như là tới não, tới xương, …) và bệnh sử, cũng như tiền sử hút thuốc. Có nhiều phương pháp khác nhau để chẩn đoán ung thư phổi, như là: thử đờm; sinh thiết phổi; nội soi phổi; nội soi trung thất; chọc lấy nước màng phổi; chụp quang tuyến cắt lớp, hoặc/và các phương pháp để phát hiện di căn khi nghi ngờ. Tuy nhiên, nhiều bệnh khác cũng có thể có một số triệu chứng tương tự.
Vì vậy, sử dụng các kháng thể đơn dòng để xác định các kháng nguyên đặc trưng ung thư phổi có ý thực tiễn rất thiết thực. Các kháng nguyên thường được sử dụng trong chẩn đoán ung thư phổi như carcinoembryonic antigen (CEA), cytokeratin 19 (CYFRA 21-1), (10), neuron speciíìc enolase (NSE), CA125,… Trong đó các kháng nguyên CYFRA 21-1 và TPA đặc trưng cho ung thư phổi tế bào không nhỏ. Các KIT chẩn đoán tạo ra từ kháng thể đơn dòng đặc hiệu các kháng nguyên này đang được sử dụng để chẩn đoán ung thư phổi (8,9).
Tuy nhiên, để tạo được kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên đich Cyfra21-1 thì việc thu nhậ kháng nguyên này đóng vai trò rất quan trọng. Chính vì vậy, chúng tôi ddawtj nhiệm vụ thu nhận kháng nguyên Cyfra21-1 bằng kỹ thuật gen làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.    vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên Cyfra 21-1 đã tách dòng trong vector PCR 2.1. Cặp mồi sử dụng; Vector tách dòng PCR 2.1, vector biểu hiện pET-21a(+); Các chủng E.coli TOPIO, BL21 (DE3). Các enzyme Taq DNA Polymerase, Ndel, A7ỉo/,…Ampicillin, X-gal, cao nấm men, Tryptone, Agar, ỊPTG, Tris-bazơ, EDTA, SDS, EtBr, Chloroíòrm, Isoamylalcohol, Agarose.
Sử dụng các phương pháp trong sinh học phân tử (PCR, cắt gắn gen, biến nạp, điện di, ách dòng gen, xác định trình tự nucleotide của các gen đã tách dòng, tunh sạch protein, khối phổ,..) của Sambrook (7)
3.    Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Tách dòng đoạn gen mã hỏa phần quyết định kháng nguyên của Cyfra 21-1.
Phản ứng nhân bản gen mã hóa Cyfra 21-1 từ vector PCRđ2.1 được thực hiện với cặp mồi có vị trí nhận biết của các enzyme gí ới h ạn Ndel và Xhol như sau: ExpcyF: 5’- catatgggcaggtcc-3’ ExpcyR: 5 ’-ctcgaggtccatgagccgctggtac-3 ’
Thành phần của phản ứng gồm: DNA khuôn, dNTPs, mồi EXPCYF và EXPCYR, enzym Taq-DNA polymerase, dung dịch đệm, dung dịch MgCl2 nước với tỷ lệ thích hợp trong tổng thể tích 25i. Chu trình nhiệt: 94oC 4 phút; 25 chu kỳ (94°c 30 giây, 54 c 3 0 giây, 72°c 60 giây); 72°c 5 phút và ‘lưu ở 4°c.