TIỀN MẪN CẢM BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH GẮN MEN (ELISA)

(Panel reactive antibody test by ELISA)

 

NGUYÊN LÝ

Kháng thể kháng HLA có thể hình thành trong cơ thể người bệnh do đã được tiếp xúc với kháng nguyên trước.

Huyết thanh của người bệnh được ủ với một phiến phản ứng gồm nhiều giếng, các giếng đó được phủ các loại kháng nguyên hệ HLA khác nhau. Nếu có phản ứng kháng nguyên – kháng thể đặc hiệu xảy ra, kháng thể đó sẽ được phát hiện bằng hệ thống kháng thể thứ hai kháng IgG người vì hệ thống phát hiện bao gồm có cơ chất tạo màu và enzym xúc tác (theo nguyên lý ELISA). Nếu phản ứng tạo màu xảy ra ở giếng nào (có màu xuất hiện) thì chứng tỏ trong huyết thanh người bệnh có kháng thể đặc hiệu phản ứng với một hoặc một vài kháng nguyên có trong giếng đó. Xét nghiệm này thường được chỉ định để phát hiện kháng thể kháng HLA bất thường trước ghép, hoặc để kiểm tra đánh giá sự hình thành của kháng thể kháng HLA sau ghép.

CHỈ ĐỊNH

Các trường hợp chuẩn bị ghép đồng loại.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên và cử nhân xét nghiệm được đào tạo thực hiện kỹ thuật;

Bác sĩ: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

Phương tiện – Hóa chất

Phương tiện

Máy đọc ELISA vi giếng (đọc được phiến Terasaki);

Bộ pipet man 10, 20, 200, và 1000 µl;

Máy ly tâm ống máu;

Que thủy tinh.

Găng tay, giấy thấm.

Hóa chất

Bộ kít tiền mẫn cảm bao gồm:      

+ Dung dịch rửa;

+ Dung dịch pha loãng mẫu;

+ Huyết thanh chứng dương;

+ Dung dịch cộng hợp;

+ Dung dịch cơ chất tạo màu;

+ Dung dịch ngưng phản ứng;

+ Phiến nhựa vi giếng có gắn sẵn các hỗn hợp kháng nguyên hệ HLA. (thường hãng sản xuất cung cấp tài liệu dạng sơ đồ cho biết kháng nguyên trong có từng giếng).

Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.

Mẫu bệnh phẩm

Mẫu dùng là mẫu huyết thanh tách từ máu không chống đông.

Mẫu cho xét nghiệm có thể bảo quản 7 ngày ở nhiệt độ 2 – 8^oC. Muốn bảo quản lâu hơn, mẫu huyết thanh phải được giữ âm sâu (≤ – 20^oC).

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Chuẩn bị mẫu

Lấy 2ml máu ngoại vi vào ống nghiệm không chống đông, ghi rõ thông tin người bệnh: tên, tuổi, số giường, khoa phòng, đúng với thông tin trên phiếu chỉ định.

Tách huyết thanh: để mẫu đông tự nhiên. Dùng que thủy tinh tách lớp huyết thanh đông khỏi thành ống.

Ly tâm ống máu đông 2000 vòng/phút trong 3 phút, sẽ thu được lớp huyết thanh màu vàng nổi lên phía trên.

Pha loãng huyết thanh người bệnh bằng dung dịch pha loãng mẫu theo hướng dẫn của nhà sản xuất kít.

Chuẩn bị hóa chất

Đưa hóa chất ra nhiệt độ phòng, pha dung dịch rửa, huyết thanh chứng, cộng hợp, và cơ chất tạo mầu về nồng độ phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Tiến hành xét nghiệm

Đưa phiến phản ứng ra nhiệt độ phòng 15 phút.

Nhỏ bệnh phẩm, dung dịch pha loãng kháng thể (giếng blank), và huyết thanh chứng vào các vị trí đã quy định trên phiến (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

Ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 20 uL/giếng, mỗi lần để 2 phút.

Nhỏ 10 uL cộng hợp vào mỗi giếng, ủ 40 phút.

Rửa 2 lần bằng dung dịch rửa, 20 uL/giếng, mỗi lần để 2 phút.

Nhỏ 10 uL Substrate vào mỗi giếng, ủ 15 phút.

Nhỏ 10 uL dung dịch ngưng phản ứng vào mỗi giếng. Đọc kết quả trên máy đo ELISA dùng cho phiến Terasaki, dùng phần mềm của hãng sản xuất kít.

Kết quả được xuất dưới dạng các giếng âm tính và dương tính.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Mẫu xét nghiệm được đọc kết quả như sau:

+ Các giếng chứng dương xuất hiện màu rõ (thường là màu xanh lam).

+ Các giếng chứng âm không bắt màu.

Nếu không đạt các yêu cầu trên thì xét nghiệm phải tiến hành lại.

Cách đọc kết quả: kết quả được đọc dưới dạng « âm tính » hoặc « % dương tính ». Cách tính toán như sau:

% dương tính = (số giếng dương tính)/ Tổng số giếng phản ứng cho 1 người bệnh.

Ghi chú: Giếng dương tính: là giếng có phản ứng cho màu xanh lam. Tổng số giếng phản ứng: là tổng số giếng dùng cho 1 người bệnh đã loại đi các giếng dùng làm chứng âm, chứng dương và chứng blank.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.

Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

Các mẫu chứng dương lại âm tính dương hoặc mẫu chứng âm lại dương tính. Thường do hóa chất hết hạn hoặc do chuẩn bị hóa chất sai.

Xử trí: kiểm tra hạn sử dụng của hóa chất, không dùng hóa chất hết hạn. Làm lại xét nghiệm và tuân thủ đúng các bước trong quy trình.

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

One Lambda, 2010. Lamda Antigen Tray Class I and Class II 88 antigen panel. User manual.