Tính kháng kháng sinh của một số chủng Salmonella và Shigella phân lập từ năm 1990 đến 1992 và 1995 đến 1997 ở Việt Nam

Như vậy số trường hợp mắc bệnh ia chảy có chiều hướng tăng lên trong những năm gần đây ở nước ta. Trong đó ỉa chảy do hai càn nguyên là Salmonella và Shigella chiếm một số lượng đáng kẻ. Cũng theo số liệu của Vụ Y tế dự phòng – Bộ y tế thì tình hình mắc bệnh ihương hàn và lv trực khuẩn ở nước ta trong giai đoạn 1990 – 1998 như sau:

Sổ mắc / 100.000 dán

Năm Thương hàn Lỵ trực khuẩn

1990 5.7 61,0

1991 4,9 26,4

1992 5.8 21,8

1993 13,7 39,9

1994 21.4 58,8

1995 30,4 64,4

1996 29,3 68.9

1997 19.4 67,3

1998 20,8 71,0

Như vậy, số lượng bệnh nhân mắc bệnh lỵ trực khuẩn hàng năm rất lớn và từ n<ìm 1993 trờ lại dây số bệnh nhân mắc bệnh thương hàn ngày một tăng nhanh.Việc điểu trị ia cháy do hai cãn nguyên này chù yếu dựa vào kháng sinh. Năm 1935 sulfamid lẩn dầu tiên được Dỡĩnagk đưa vào sử dụng để điểu trị ỉa chảy do Shigella [158]. Năm 1948 kháng sinh chloramphenicol (Cm) 

được Woodwwcl chính thức đưa vào điều trị bệnh ihưcmg hàn 1144]. Vấn để sử dụng kháns sinh đế điểu trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột nói chung và đặc biệt là nhiễm khuẩn do Salmonella và Shigella đã mở ra một kỷ nguyên mới trong công tác điều trị cùa các thầy thuốc lâm sàng, kháng sinh đã đóng vai trò rất lớn. Nhưng kháng sinh đà được dùng hết sức rộn2 rãi và tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh ngày một tăng cao, chính diều đổ dà nhanh chónũ làm xuấl hiện những chủng vi khuẩn kháng lại ihuốc kháng sinh: từ năm 1939 (chi sau khi sừ dụng có 4 nãm) đã có những thông báo vể sự kháng sulfamid của chùng Shigeìla. Năm 1949, ở Nhật Bán sau 10 nãm sừ dụns có 80 – 90% Shigella kháng lại sulfamid. Ở Việt nam, năm 1950 Farinaud đã thử nghiệm đưa chloromỵcctin vào điều trị thương hàn lần dầu tiên tại bệnh viện Grall Sài Gòn [154). Trong vòng khoảng 20 nám đầu sử dụng, Cm đã làm giảm tỷ lệ tử vong từ 20% xuống còn 1% và thời gian sốt từ 14-28 ngày xuống còn 3-5 ngày [145]. Và năm 1971, lần đầu ticn chủng s. typhi kháng Cm đà (iược phân lập ở miền Nam Việt nam bởi hai tác giả Ngọc Linh và Arnold. Nhưng ngược lại, để điều trị bệnh lỵ trực khuẩn do Shigella bằng kháns sinh dà trở thành một vấn đề nan giải từ nửa thế kỷ nay. Từ năm 1952 chùng Shigella kháng đa kháng sinh: kháng tetracyđin (Tc), Streptomycin (Sm), Sulfamethoxazol (Su) đã được phân lập lần đáu tiên, ờ Việt nam vào những năm 1973-1974 Shigella đã kháng với các kháng sinh Cm, Tc, Su từ 70% đến 100% [4], [21]. Từ đó đến nay tính nhạy cảm với kháng sinh của hai loài Salmonella và Shigella ờ trẽn thế giới nói chung và ở Việt nam nói riêng đã thay đổi rất nhiều, khiến nhiều nhà vi khuẩn học và các thầy thuốc lâm sàng rất quan tâm. Do dó việc giám sát mức độ đề kháng kháng sinh cùa các vi khuẩn gây nhiễm trùng dường ruột nói chung và đặc biột là hai căn nguyên thường gặp: Salmonella và Shigella là việc làm cán thiết cùa các nhà vi khuẩn học nhảm cung cấp các thông tin mới giúp các  thầy thuốc làm sàng sử dụng kháng sinh hợp lý và có hiệu quả. Hơn nữa. muốn phòng chống sự lan truyền tính kháng kháng sinh của vi khuẩn, theo V kiến của Wiedemann 1979 [162] cần phải có những hiểu biết vẻ dịch tẻ học phân tử tính kháng thuốc, tức là nắm được cốt lõi cúa sự đề kháng. Vi khuẩn đường ruột kháng lại kháng sinh chủ yếu là do R-plasmid [61], chúng có thể truyền sang vi khuẩn khác khi tiếp hợp (conjugation) hay thỏng qua phage (transduction-tải nạp) hoặc khi tế bào bị ly giải, giải phóng ra ADN tự do (transformation-bicn nạp). Như vậy các R-plasmid khòng những dược ỉan truyền dọc từ thế hệ trước sang thế hệ sau mà còn lan truyền ngang sang các vi khuẩn khác cùng loài [70].

Luận án M Tính kháng kháng sinh của một số chủng Salmonella và Shigella phân lập từ năm 1990 đến 1992 và 1995 đến 1997 ở Việt nam” được tiến hành nhằm thực hiện các mục ticu sau:

1. Tim hiểu tính kháng kháng sinh ờ hai loại vi khuản này thuộc ba miền khác nhau của Việt nam trong hai giai đoạn 1990 – 1992 và 1995- 1997.

2. Tìm hiểu các plasmid đề kháng tự truyền ờ hai loại vi khuẩn này thuộc ba miền khác nhau cùa Việt nam.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. KHÁNG SINH 

1.2.1. Kháng sinh ức chế quá trình tỏng hợp vách 6

1.2.2. Kháng sinh tác động trên màng nguyên iưưng 7

1.2.3. Kháng sinh ức chế quá irình sinh lổng hợp protcin 8

1.2.4. Kháng sinh ức chế sinh tổng hợp acid nucleic 9

1.2.5. Kháng sinh ức chế sinh tổng hợp acid folic 9 

 

1.2. VI KHUẨN ĐỂ KHÁNG KHÁNG SINH 11

1.2.1. Cơ chế của sự đề kháng ihu dược 12

1.2.2. Cơ sớ di truyền học của sự dể kháng thu được 13

1.2.2.1. Đé kháng ihu được do đột biến trên NST 13

1.2.2.2. Đề kháng thu dược do nhộn dược gen dé kháng qua

tái tổ hợp chất liệu di truyển trên NST 15

1.2.2.3. Để kháng thu dược do nhận R-p!asmid và các hình

thức vận chuycn di truyển cùa plasmid 22

1.2.2.4. Đề kháng thu dược do nhận được gen đề kháng nhờ

thành phần di truyền di động 22

1.2.2.5. Cơ chế lan truyền gen để kháng 23

1.3. PLASMID 24

1.3.1. Định nghĩa 24

1.3.2. Lịch sử nghiên cứu vc R-plasmid 25

1.3.3. Dịch lẻ học của R-p]asmid 28

1.3.4. Độ lớn cùa R-plasmid 29 

1.3.5. Số lượng R-plasmid trong tế bào vi khuẩn 30

1.3.6. Cấu trúc của R-plasmid 30

1.3.7. Phân loại của R-plasmid 32

1.3.7.1. Phân loại theo khả năng lan Iruyén 32

1.3.7.2. Phàn loại theo tính tương đổng 32

1.3.8. Cơ chế lan truyền của R-plasmid 33

1.3.8.1. Sự truyền dọc 33

1.3.8.2. Sự truyền ngang 33

1.3.9. Tiến hóa của R-plasmid 35

1.3.9.1. Sự tồn tại của plasmid khi chưa có thuốc 35

1.3.9.2. Nguổn gốc của R-plasmid 36

1.3.9.3. Tiến hóa của R-plasmid 37

1.4. ENZYM GIỚI HẠN 38

•

1.4.1. Hệ thống giới hạn sửa đổi 38

1.4.2. Phủn loại enzym 39

1.4.3. Enzym giới hạn loại II 41

1.5. TÌNH HÌNH MẮC BỆNH THƯƠNG HÀN, LỴ TRỰC

KHUẨN VÀ VIỆC ĐIỂU TRỊ BANG KHÁNG SINH 43

1.5.1. Tình hình mắc bệnh thương hàn 43

1.5.2. Việc sừ dụng kháng sinh trons điều trị bệnh thương hàn 44

1.5.3. Sự gia tăng tính kháng kháng sinh của Salmonella 45

1.5.4. Tinh hình mắc bệnh lỵ trực khuẩn 50

1.5.5. Việc sử dụng kháng sinh trong điéu trị bệnh ỉv trực khuẩn 51

1.5.6. Sự gia tăng tính kháng kháng sinh cùa Shigella : 51

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 55

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN cứu 55

2.1.1. Địa điểm nghiên cứu 55

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 56

2.1.3. Thời gian nghiên cứu 56

2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN cúu 56

2.2.1. Kháng sinh 56

2.2.1.1. Khoanh giấy kháng sinh 56

2.2.1.2. Kháng sinh bột 56

2.2.2. Chủng quốc tế 56

2.2.3. Môi trường 57

2.2.3.1. Môi trường ngoại 57

2232. Môi trường do Viện Vệ sinh Dịch té Trung ương

sản xuất 58

2.2.4. Hoá chất và sinh phẩm 60

2.2.4.1. Dung dịch đệm PBS 60

2.2.4.2. Dung dịch Me Farland 0,5 60

2.2A3. Hoá chất dùng làm dung mỏi hoà tan bột kháng sinh 61

2.2A4. Hoá chất dùng trong kỹ thuật lách chiết plasmid 61

2.2.4.5. Dung dịch dùng trong phương pháp tách chiết plasmid… 61

2.2.4. Ó. Các sinh phẩm 62

2.2.4.6.1. Kháng huyết thanh 62

2.2.4. Ó.2. Các enzym giới hạn và ?1-ADN chuẩn 63

2.2.5. Máy móc và dụng cụ 63

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 65

2.3.1. Phương pháp nghiên cứu 65

2.3.2. Các kỹ thuật nghiên cứu 65

2.3.2.1. Kiểm tra tính sinh vật hoá học và định type huyết

thanh các chủng thu thập 65

2322. Kiểm tra tính nhạy cảm kháng sinh của các chùng

s.ryphi và Shigella bằng hai phương pháp 66

232.2.1. Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán 66

23.2.22. Kỹ thuật xác định nồng dộ kháng sinh tối thiểu

ức chế vi khuẩn (MIC) 70

2.3.2.3. Kỹ thuật tiếp họp xác dịnh R-plasmid tự truyền 73

23.23A. Kỹ thuật tiếp hợp trên mặt thạch 73

2.3.2.3.2. Kỹ thuật sao chép 75

2.3.2.3.3. Cấy đếm xác định tần suất truyền 75

2.3.2A. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu vé plasmid 76

2.3.2.4.1. Kỹ thuật tách chiết pỉasmid 76

2.3.2A2. Phân tích mẫu có chứa plasmid

trên gel agarose 77

2.3.2.4.3. Xác cỉịnh trọng lượng phân tử của plasmid 78 2.3.2.4A Sử dụng enzym giới hạn dể phân tích cấu trúc

phân từ của các plasmid 79

2. Ĩ.2.5. Sử lý sổ liệu        81

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN cứu 82

3.1. THU THẬP CHỦNG, KIỂM TRA TÍNH CHẮT SINH VẬT

HOÁ HỌC VÀ ĐỊNH TYP HUYẾT THANH 82

■ •

3.1.1. Chủng Salmonella ty phi 82

3.1.2. Chủng Shigella 82

3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TÍNH NHẠY CÂM KHÁNG SINH

CỦA CÁC CHỦNG S.TYPHI VÀ SHIGELLA 83

3.2.1. Kết quà xác định bằng kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán 83

3.2.1.1. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng s.typhi 83

3.2.1.2. Kiểu cách đề kháng kháng sinh của các chủng s.typhi… 87

3.2.1.3. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng Shigella 89

3.2.1.4. Kiểu cách để kháng kháng sinh cùa các chủng Slìigella . 93

3.2.2. Kết quả xác định hoạt tính cùa mội số kháng sinh đối với hai vi

khuẩn s.typhi và Shigella 95

3.2.2.1. Kết quả xác định hoạt tính của một số kháng sinh đối

với s.ryphi 95

3.2.2.2. Kết quả xác định hoạt tính của một số kháng sinh dối

với Shigella 1 97

3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NÂNG LAN TRUYỂN GEN

ĐỂ KHÁNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIẾP HỢP 99

•

3.3.1. Kết quả xác định khả nâng lan truyền gen dc kháng của các

chủng s.typhi 100

3.3.2. Kết quả xác định khả năng lan truyền gen dề kháng của các

chủng Shigella 103

3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA PLASMip-ADN ở CÁC CHỦNG S.TYPHI THUỘC BA MIỂN BẮC-TRUNG-NAM GIAI ĐOẠN 1995-1997 106

3.5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC PHÂN TỦ PLASMIl)-

ADN CHỨA CÁC GEN MẢ HÓA sự KHÁNG KHÁNG SINH .. 117

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 126

4.1. ĐÁNH GIÁ MỨC Độ NHẠY CẢM VỚI KHÁNG SINH CỦA

CÁC CHỦNG s. TY PHI TỪ BA MlỂN bắc – TRUNG – NAM TRONG HAI GIAI ĐOẠN 1990-1992 VÀ 1995 -1997 126

4.1.1. Bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán 126

4.1.2. Bầns kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 129

4.1.3. Đánh giá về kiểu cách để kháng cùa s. typhi 129

4.2. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ NHẠY CẢM VỚI KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG SHIGELLA TỪ BA MlỂN BẮC – TRUNG • NAM TRONG HAI GIAI ĐOẠN 1990-1992 VÀ

1995 -1997. 130

4.2.1. Bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán 130

4.2.2. Bằns kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối ihiểu (MIC) 133

4.2.3. Đánh giá vé kiểu cách đề kháng của Shigella 134

4.3. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG LAN TRUYỂN GEN để kháng KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG s. TYPHl THUỘC BA

MIỀN BẮC-TRUNG-NAM GIAI ĐOẠN 1995-1997 135

4.4. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG LAN TRUYỀN GEN ĐỀ KHÁNG

KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG SHIGELIA THUỘC BA MIỀN BẮC-TRUNG-NAM GIAI ĐOẠN 1995-1997 137 

4.5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA CÁC

• • •

PLASMID-ADN ở CÁC CHỦNG s. TY PHI

4.6. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC PHÂN TỬ PLASMID-

ADN CHỨA CÁC GEN MÃ HÓA sự KHÁNG KHÁNG SINH…. 141

KẾT LUẬN 142

KIẾN NGHỊ 145

CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN cứu có LIÊN

QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 146

TÀI LIỆU THAM KHẢO 147