TỔNG HỢP VÀ THIẾT LẬP TẠP CHẤT ĐỐI CHIẾU CỦA. ALLOPURINOL SỬ DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TỔNG HỢP VÀ THIẾT LẬP TẠP CHẤT ĐỐI CHIẾU CỦA. ALLOPURINOL SỬ DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM.Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp dược trên thế giới, ngành dược Việt Nam cũng đã phát triển và khẳng định được vị thế của mình. Trên cả nước, với hơn 280 nhà máy sản xuất dược phẩm đạt GMP-WHO, GMP-EU sản xuất các thành phẩm, đa phần là thuốc generic, trong đó phổ biến nhất là nhóm thuốc kháng viêm, thuốc điều trị bệnh gút, thuốc kháng sinh, thuốc điều trị đái tháo đường và thuốc tim mạch.1
Trong các nhóm thuốc điều trị bệnh gút mạn tính hay tăng acid uric huyết, allopurinol đã được Bộ Y tế đưa vào danh mục thuốc thiết yếu năm 2018 và được chỉ định thường quy trong điều trị bệnh gút và tăng uric huyết thứ phát do hóa trị bệnh bạch cầu hay ung thư.2,3 Do đó allopurinol là một trong các thuốc được sản xuất bởi nhiều công ty dược phẩm trong nước như Dược Hậu Giang, Domesco, Stella, Pharmedic, Agimexpharm… Tuy nhiên kiểm tra tạp liên quan allopurinol gặp nhiều khó khăn do hệ thống kiểm nghiệm trong nước chưa cung cấp chuẩn tạp đầy đủ.4-6
Hiện nay, ngành công nghiệp dược nước ta vẫn còn phụ thuộc nhiều vào nguồn nguyên liệu allopurinol được nhập khẩu từ các công ty nước ngoài. Do đó, việc kiểm tra chất lượng nguyên liệu đầu vào cũng như thành phẩm trước và trong quá trình lưu hành cần được đặt lên hàng đầu, nhằm đảm bảo chất lượng các chế phẩm nội địa cũng như kiểm soát chất lượng các chế phẩm ngoại nhập từ hoạt chất allopurinol.
Trong quá trình tổng hợp, sản xuất, bảo quản, allopurinol vẫn còn tồn tại hoặc phát sinh các tạp chất liên quan có khả năng gây độc tính hoặc đột biến gen, ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu quả điều trị lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc đối với bệnh nhân.7 Các nghiên cứu đã cho thấy tạp A và tạp D của allopurinol là sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp. Tạp A và tạp B cũng là sản phẩm phân hủy của allopurinol khi gặp tác nhân kiềm hóa.8-12 Tạp C, E, F (theo USP Standard 2023) là các sản phẩm phụ được tạo thành từ sản phẩm trung gian với các chất tham gia phản ứng.13 Các tạp A, B, C, D, E, F đã được chứng minh có khả năng gây độc tính trên da và hội chứng Steven Johnson do tác dụng lên gen HLA-B*5801, trong đó tạp F allopurinol nằm trong nhóm cấu trúc có khả năng gây đột biến gen và ung thư.7,14
Hiện nay, các chuyên luận của các dược điển tham chiếu và DĐVN V, đều yêu cầu kiểm tra tạp chất liên quan allopurinol là một tiêu chuẩn bắt buộc trong kiểm nghiệm nguyên liệu và thành phẩm allopurinol. Dược điển Anh (BP 2023) bắt buộc kiểm tra tạp A, B, C, D, E cả trong nguyên liệu và thành phẩm allopurinol. DĐVN V và USP NF-2023 không yêu cầu kiểm tra tạp chất trong thành phẩm nhưng bắt buộc kiểm tra tạp A, B, C, D, E, F và hydrazin trong nguyên liệu allopurinol như đầu vào của quá trình đăng ký, sản xuất.15-17
Trong khi đó, các tạp chuẩn này đang được bán với giá rất đắt, phải nhập khẩu từ nước ngoài với giá bán trung bình mỗi tạp là 2500 USD/100 mg (USP standard 2023) và một số tạp lại không sẵn có như tạp F.18,19 Vì thế gây không ít khó khăn cho công tác kiểm nghiệm nguyên liệu và chế phẩm chứa allopurinol. Trên thế giới hiện có một số công trình nghiên cứu liên quan đến tạp chất của allopurinol,8,9,13,18,20-22 nhưng chưa có công trình nghiên cứu nào công bố về thiết lập tạp chuẩn, cũng như quy trình định lượng đồng thời các tạp chất liên quan trong thành phẩm bằng các kỹ thuật phân tích hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ 2 lần. Cho đến nay chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố quy trình tổng hợp các tạp liên quan allopurinol.23-56
Mục tiêu của đề tài là:
1. Tổng hợp 6 tạp chất liên quan của allopurinol A, B, C, D, E, F ở quy mô phòng thí nghiệm.
2. Xây dựng tiêu chuẩn và thiết lập tạp chất đối chiếu của allopurinol A, B, C, D, E, F đạt yêu cầu chất đối chiếu quốc gia.
3. Xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS.
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
LỜI CAM ĐOAN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT v
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC SƠ ĐỒ xi
DANH MỤC HÌNH xiii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về allopurinol và tạp chất liên quan 3
1.2. Kiểm nghiệm tạp chất allopurinol theo Dược điển tham chiếu và các công trình
nghiên cứu 15
1.3. Một số phương pháp xác định độ tinh khiết 22
1.4. Chất chuẩn đối chiếu 29
1.5. Tổng quan về thẩm định quy trình theo ICH Q2(R2) và phương pháp LC-
MS/MS trong định lượng tạp chất liên quan 35
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41
2.1. Thiết kế nghiên cứu 41
2.2. Đối tượng nghiên cứu 42
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 42
2.4. Cỡ mẫu của nghiên cứu 42
2.5. Xác định các biến số độc lập và biến phụ thuộc 42
2.6. Phương pháp và công cụ đo lường thu thập số liệu 43
2.7. Quy trình thu thập và cách phân tích số liệu 45
2.8. Phương pháp phân tích dữ liệu 63
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 64
3.1. Tổng hợp và tinh chế tạp chất liên quan của allopurinol 64
3.2. Xây dựng tiêu chuẩn và thiết lập tạp chất đối chiếu của allopurinol 82
3.3. Xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B,
C, D, E, F của allopurinol bằng LC-MS/MS 100
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 109
4.1. Bàn luận về quy trình tổng hợp và tinh chế 6 tạp của allopurinol 109
4.2. Bàn luận về xây dựng và đánh giá tạp chất đối chiếu của allopurinol 135
4.3. Bàn luận về xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời
6 tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol bằng LC-MS/MS 142
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 149
5.1. Về tổng hợp 6 tạp chất liên quan của allopurinol A, B, C, D, E, F ở quy mô phòng thí nghiệm 149
5.2. Về thiết lập tạp chuẩn A, B, C, D, E, F đạt yêu cầu chất đối chiếu quốc gia 149
5.3. Về xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A,
B, C, D, E, F của allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS 150
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1. Giới hạn các tạp allopurinol theo DĐVN V; BP 2023; USP-NF 2023… 15
Bảng 1. 2. Bảng tổng hợp các quy trình định lượng tạp chất liên quan allopurinol trong nguyên liệu 16
Bảng 1. 3. Bảng tổng hợp các quy trình định lượng tạp chất liên quan allopurinol trong thành phẩm 20
Bảng 1. 4. Quy định xác định độ tinh khiết 25
Bảng 1. 5. Các quy trình phân tích và các chỉ tiêu liên quan cho đặc điểm từng quy trình phân tích 36
Bảng 1. 6. Các tiêu chí thẩm định quy trình phân tích tạp trong nguyên liệu và thành
phẩm theo hướng dẫn Q2(R2) của ICH 37
Bảng 2. 1. Một số nguyên liệu, chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 43
Bảng 2. 2. Một số dung môi hóa chất dùng trong nghiên cứu 43
Bảng 2. 3. Một số trang thiết bị dùng trong nghiên cứu 44
Bảng 2. 4. Các thông số khối phổ cần khảo sát quy trình định lượng đồng thời 6 tạp
allopurinol bằng LC-MS/MS 60
Bảng 2. 5. Điều kiện sắc ký cần khảo sát quy trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurniol bằng LC-MS/MS 60
Bảng 2. 6. Nồng độ các tạp và allopurinol trong tuyến tính 61
Bảng 3. 1. Tóm tắt điều kiện sắc ký các quy trình định lượng các tạp allopurinol bằng phương pháp HPLC-DAD 83
Bảng 3. 2. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống (n = 6) 84
Bảng 3. 3. Kết quả xác định miền giá trị, độ đúng, độ chính xác của các quy trình định lượng các tạp chất 91
Bảng 3. 4. Kết quả xác định hàm lượng (%) tính theo chế phẩm nguyên trạng của các tạp chất allopurinol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 92
Bảng 3. 5. Kết quả đánh giá chất lượng tạp A allopurinol 92
Bảng 3. 6. Kết quả đánh giá chất lượng tạp B allopurinol 93
Bảng 3. 7. Kết quả đánh giá chất lượng tạp C allopurinol 94
Bảng 3. 8. Kết quả đánh giá chất lượng tạp D allopurinol 94
Bảng 3. 9. Kết quả đánh giá chất lượng tạp E allopurinol 95
Bảng 3. 10. Kết quả đánh giá chất lượng tạp F allopurinol 96
Bảng 3. 11. Khối lượng chất khảo sát đóng trong 1 lọ và số lọ đóng được 96
Bảng 3. 12. Kết quả đánh giá đồng nhất lọ sau khi đóng gói 97
Bảng 3. 13. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp A allopurinol (n = 18) 97
Bảng 3. 14. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp B allopurinol (n = 18) 98
Bảng 3. 15. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp C allopurinol (n = 18) 98
Bảng 3. 16. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp D allopurinol (n = 18) 98
Bảng 3. 17. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp E allopurinol (n = 18) 99
Bảng 3. 18. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp F allopurinol (n = 18) 99
Bảng 3. 19. Tóm tắt kết quả xác định giá trị ấn định và công bố các tạp đối chiếu
100
Bảng 3. 20. Tóm tắt kết quả đánh giá các tạp allopurinol tổng hợp 100
Bảng 3. 21. Điều kiện khối phổ tối ưu quy trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol
bằng phương pháp LC/MS/MS 101
Bảng 3. 22. Kết quả kiểm tra tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn (n = 6) . 102
Bảng 3. 23. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử 102
Bảng 3. 24. Phương trình tuyến tính của quy trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS 104
Bảng 3. 25. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng các tạp allopurinol 104
Bảng 3. 26. Kết quả độ chính xác và độ chính xác trung gian của quy trình định lượng đồng thời 6 tạp trong mẫu giả lập nguyên liệu allopurinol 105
Bảng 3. 28. Kết quả độ đúng của quy trình định lượng đồng thời 6 tạp trong nền mẫu
giả lập thành phẩm và giả lập nguyên liệu allopurinol 107
Bảng 3. 29. Kết quả định lượng tạp trong các mẫu nguyên liệu và thành phẩm
allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS 108
Bảng 4. 1. Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp so với phổ tạp A allopurinol
hemisulfat chuẩn 111
Bảng 4. 2. Dữ liệu phổ NMR sản phẩm tổng hợp so với phổ tạp B allopurinol chuẩn
117
Bảng 4. 3. Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp so với tạp C allopurinol chuẩn
122
Bảng 4. 4. Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp so với tạp D allopurinol chuẩn
126
Bảng 4. 5. Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp so với tạp E allopurinol chuẩn
130
Bảng 4. 6. Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp so với tạp F allopurinol chuẩn
theo tài liệu tham khảo 134
Bảng 4. 7. Bảng so sánh Lenene – Test 141
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1. 1. Quy trình tổng hợp allopurinol theo Roland K. Robin 3
Sơ đồ 1. 2. Quy trình tổng hợp allopurinol theo Jean Druey 4
Sơ đồ 1. 3. Nguồn gốc phát sinh tạp A của allopurinol 6
Sơ đồ 1. 4. Quy trình tổng hợp tạp A theo Roland K. Robins 6
Sơ đồ 1. 5. Quy trình tổng hợp tạp A theo Ronald M. Cresswell 6
Sơ đồ 1. 6. Quy trình tổng hợp tạp A 7
Sơ đồ 1. 7. Nguồn gốc phát sinh tạp B allopurinol 8
Sơ đồ 1. 8. Nguồn gốc phát sinh tạp C allopurinol 9
Sơ đồ 1. 9. Nguồn gốc phát sinh tạp D allopurinol 10
Sơ đồ 1. 10. Quy trình tổng hợp tạp D allopurinol 11
Sơ đồ 1. 11. Quy trình tổng hợp tạp D allopurinol theo Sindhu Jose 11
Sơ đồ 1. 12. Nguồn gốc phát sinh tạp E 12
Sơ đồ 1. 13. Nguồn gốc phát sinh tạp F 13
Sơ đồ 2. 1. Phân hủy allopurinol bằng NaHCO3 45
Sơ đồ 2. 2. Phân hủy allopurinol bằng NH3 46
Sơ đồ 2. 3. Phân hủy allopurinol bằng NaOH 46
Sơ đồ 2. 4. Quy trình phản ứng tổng hợp tạp B 47
Sơ đồ 2. 5. Sơ đồ tổng hợp tạp C với tác nhân 1,2-diformylhydrazin 47
Sơ đồ 2. 6. Sơ đồ tổng hợp tạp C với tác nhân acid formic và hydrazin 47
Sơ đồ 2. 7. Sơ đồ tổng hợp tạp D allopurinol 48
Sơ đồ 2. 8. Sơ đồ tổng hợp tạp E từ tạp D allopurinol và triethyl orthoformat 48
Sơ đồ 2. 9. Sơ đồ tổng hợp tạp E từ tạp D allopurinol và acid formic 49
Sơ đồ 2. 10. Sơ đồ tổng hợp tạp F từ tạp D allopurinol và triethylorthoformat 49
Sơ đồ 2. 11. Sơ đồ tổng hợp tạp F từ tạp D allopurinol và hydrazin hydrat 50% ….49
Sơ đồ 3. 1. Quy trình tổng hợp tạp A allopurinol hemisulfat 67
Sơ đồ 3. 2. Quy trình tổng hợp tạp B allopurinol 70
Sơ đồ 3. 3. Quy trình tổng hợp tạp C allopurinol 73
Sơ đồ 3. 4. Quy trình tổng hợp tạp D allopurinol 76
Sơ đồ 3. 5. Quy trình tổng hợp tạp E allopurinol 79
Sơ đồ 3. 6. Quy trình tổng hợp tạp F allopurinol 81
Sơ đồ 4. 1. Sự phân mảnh của tạp A allopurinol 111
Sơ đồ 4. 2. Cơ chế phản ứng tổng hợp tạp B allopurinol 115
Sơ đồ 4. 3. Cơ chế phản ứng tổng hợp tạp C allopurinol 121
Sơ đồ 4. 4. Cơ chế phản ứng đóng vòng tạp D allopurinol 125
Sơ đồ 4. 5. Cơ chế phản ứng Wolff-Kisser tạo nhóm hydrazid 127
Sơ đồ 4. 6. Phương trình minh họa 2 giai đoạn của phản ứng tổng hợp tạp E 128
Sơ đồ 4. 7. Cơ chế đề nghị phản ứng tổng hợp tạp E từ tạp D và triethyl orthoformat
129
Sơ đồ 4. 8. Cơ chế đề nghị phản ứng tổng hợp tạp E từ tạp D và acid formic 129
Sơ đồ 4. 9. Cơ chế tự phản ứng tạo ra tạp F 133
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1. Sơ đồ khối của máy phân tích nhiệt vi sai 23
Hình 1. 2. Sơ đồ cấu tạo hệ thống LC-MS/MS 39
Hình 1. 3. Chế độ quét phổ MRM trong LC/MS-MS 40
Hình 2. 1. Trình tự các nội dung nghiên cứu 41
Hình 3. 1. Phổ MS dung dịch sản phẩm tổng hợp tạp F theo phương pháp 1 79
Hình 3. 2. Sắc ký đồ dung môi pha mẫu, mẫu thử tạp A allopurinol, hỗn hợp chuẩn
tạp A và allopurinol, allopurinol nguyên liệu ở bước sóng 220 nm 85
Hình 3. 3. Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp A allopurinol 85
Hình 3. 4. Sắc ký đồ dung môi pha mẫu, tạp B allopurinol, mẫu thử tạp A allopurinol; hỗn hợp chuẩn tạp B và tạp A allopurinol ở bước sóng 220 nm 86
Hình 3. 5. Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp B allopurinol 86
Hình 3. 6. Sắc ký đồ dung môi pha động, allopurinol chuẩn, tạp C allopurinol phân hủy, tạp B allopurinol chuẩn, tạp A allopurinol nguyên liệu, hỗn hợp chuẩn tạp A, B, C allopurinol chế độ UV 200 nm 87
Hình 3. 7. Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp C allopurinol 87
Hình 3. 8. Sắc ký đồ dung môi pha mẫu định lượng tạp D allopurinol 88
Hình 3. 9. Sắc ký đồ sản phẩm tinh chế tạp D allopurinol 88
Hình 3. 10. Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp D allopurinol 88
Hình 3. 11. Sắc ký đồ dung môi pha mẫu định lượng tạp E allopurinol 89
Hình 3. 12. Sắc ký đồ sản phẩm tinh chế tạp E allopurinol 89
Hình 3. 13. Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp E allopurinol 89
Hình 3. 14. Sắc ký đồ dung môi pha mẫu, dung môi pha động, tạp D, nguyên liệu
tổng hợp; tạp F thử và hỗn hợp chuẩn tạp F 90
Hình 3. 15. Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp F allopurinol 90
Hình 3. 16. Sắc ký đồ dung môi pha mẫu, tá dược, mẫu phân hủy, hỗn hợp chuẩn tạp
A, B, C, D, E, F và allopurinol 103
Hình 4. 1. Cơ chế phản ứng tổng hợp tạp A allopurinol hemisulfat 110
Hình 4. 2. Phổ IR sản phẩm tổng hợp và tạp A allopurinol hemisulfat chuẩn 110
Hình 4. 3. Kết tủa trắng BaSO4 trong phản ứng gốc muối hemisulfat của tạp A allopurinol 112
Hình 4. 4. Sản phẩm tạp A tạo thành khi dư NaOH 113
Hình 4. 5. Phổ IR sản phẩm tổng hợp và tạp B allopurinol chuẩn 116
Hình 4. 6. Định tính nhanh dung dịch sản phẩm tổng hợp tạp C bằng khối phổ … 119
Hình 4. 7. Phổ IR sản phẩm tổng hợp và tạp C allopurinol chuẩn 121
Hình 4. 8. Phổ IR sản phẩm tổng hợp và phổ chuẩn tạp D allopurinol 125
Hình 4. 9. Phổ IR sản phẩm tổng hợp và tạp E allopurinol chuẩn 129
Hình 4. 10. Phổ IR sản phẩm tổng hợp và tạp F allopurinol chuẩn 133
Hình 4. 11. Phân mảnh ion định lượng của 6 tạp A, B, C, D, E, F và allopurinol . 143
Nguồn: https://luanvanyhoc.com