Ứng dụng công nghệ gen trong xác định thành phan loài ký sinh trùng ở Việt Nam

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về đa dạng sinh học của sinh vật, trong đó có bảo tổn và lưu giữ nguồn gen đông vật, thực vật và vi sinh vật. Sự phân bố của các loài ký sinh trùng nói chung đã được xác định trên phạm vi toàn cầu. Song, nghiên cứu bảo tồn và lưu giữ nguồn gen của ký sinh trong từng khu vực và trong từng nước hãy còn nhiều điều cần được khám phá và nghiên cứu bổ sung. Việc chẩn đoán, giám định và phân loại nhiều loại sinh vật, trong đó có ký sinh trùng cho đến nay vẫn dựa vào hình thái học là chính. Mặc dầu hình thái học (kiểu hình) phải là hướng định trong phân loại và đã có những thành tựu hết sức to lớn, nhưng trong nhiều trường hợp còn gặp khó khăn để phân biệt loài và dưới loài môt cách chính xác. Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen bao gồm giữ chủng ký sinh trùng sống, giữ chủng ký sinh trùng đông lạnh hoặc trong dung dịch bảo quản hoặc giữ chủng ký sinh trùng dưới dạng gen tổng số hoặc đoạn gen đặc hiệu hoặc nhập Ngân hàng gen (Gen Bank). Những quỹ gen này là nguồn nguyên liệu quý để xây dựng bảo tàng ký sinh trùng qua nhiều thế hệ.
Công nghệ gen là môt lĩnh vực quan trọng để khám phá hệ gen bên trong, nghiên cứu cấu trúc, mối tương quan và biểu hiện kiểu gen (genotype) của đối tượng. Như vậy, nói đến công nghệ gen là nói đến cấu trúc cơ bản về gen và di truyền cũng như các kỹ thuật nhằm phục vụ cho quá trình nghiên cứu và thực nghiệm lĩnh vực này.
Trong công nghệ gen, phương pháp sinh học phân tử đang được ứng dụng ngày càng rông rãi và có hiệu quả trong mọi lĩnh vực sinh học. Đó là việc sử dụng các kỹ thuật ADN (trước hết là kỹ thuật PCR) và kỹ thuật protein để xác định chuỗi gen hay chuỗi acid amin của từng gen, cũng như lập bản đồ gen của từng khu vực nhất định trong hệ gen của loài cần chẩn đoán để so sánh đối chiếu với những loài khác, nhằm xác định chính xác loài mong muốn. Có rất nhiều phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử, trước hết phải kể đến phương pháp di truyền học tế bào, phương pháp hợp lai ADN-ADN, phương pháp hợp lai ADN phóng xạ, phương pháp phân tích biến thái phân đoạn ADN bằng kỹ thuật enzym giới hạn (RFLP), cũng như rất nhiều phương pháp sử dụng phản ứng PCR (polymerase chain reaction) hoặc phối hợp với phương pháp ADN.
Phương pháp đã được sử dụng để giám định, phân loại và lập phả hệ ký sinh trùng ở Việt Nam là phương pháp PCR. Đây là phương pháp đang được ứng dụng môt cách rông rãi và rất có hiệu quả hiện nay.
Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) được sử dụng rông rãi từ những năm đầu 1990, và thực sự là phương tiện có hiệu quả trong nghiên cứu di truyền phân tử của các loài. Chỉ cần một lượng nhỏ ADN (tinh khiết hoặc hỗn hợp), PCR có thể nhân lên hàng triệu bản sao ADN vùng cần nghiên cứu. Thông thường, nếu sử dụng kỹ thuật PCR đơn giản, đoạn ADN thu nhận được có độ dài cao nhất đến 2000-3000 nucleotid. Nếu áp dụng kỹ thuật PCR hiện đại, với enzym chịu nhiệt cao và bền, có thể thu nhận ADN có độ dài đến trên 10.000, thậm chí đến 20.000 nucleotid hoặc hơn.
PCR là phản ứng enzym xúc tác của enzym ADN polymerase chịu nhiệt, sử dụng nhiều nhất là Taq polymearase (phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus), trong môi trường có nồng độ ion Magiê (Mg++) thích hợp, với các thành phần nucleotid đầy đủ làm nguyên liệu, có hai đoạn ngắn nucleotit làm mồi (gọi là các primer). Phản ứng sẽ tiến hành tổng hợp các đoạn ADN tương ứng trên khuôn ADN trong giới hạn giữa các mồi. Sự tổng hợp ADN tăng theo cấp số 2n, sau 25-40 chu kì, sẽ cho số lượng ADN là hàng triệu bản sao. Thời gian thực hiện PCR là vài giờ, với chương trình tự động hoá nên không tốn công sức. Hiện nay, đã có máy phân tích trật tự nucleotid tự động (automated sequencer), nên sản phẩm PCR sau khi được làm sạch, sẽ được phân tích ngay rất thuận lợi cho nghiên cứu.
Phương pháp PCR không đòi hỏi ADN với lượng lớn, nên có thể sử dụng trực tiếp ADN mẫu vật để làm khuôn mà không cần phải nuôi cấy (đối với KST chẳng hạn), do vậy, loại trừ ảnh hưởng của vật chủ và môi trường đối với đối tượng nghiên cứu. Đối với phản ứng PCR, tính vô trùng phân tử phải được chú ý, tránh lẫn tạp nhiều loại ADN khác nhau.
Chỉ thị di truyền đã được áp dụng trong xác định loài ký sinh trùng ở nước ta là từ hệ gen ty thể và hệ gen nhân tế bào. Trong một tế bào động vật luôn tồn tại song song hai hệ gen: hệ gen nhân (nuclear genome) và hệ gen ty thể (mitochondrial genome). Hai hệ gen này đều có sản phẩm riêng hoạt động có tính chất vừa độc lập vừa tương tác. Dĩ nhiên hệ gen ty thể chịu ảnh hưởng điều hoà của hệ gen nhân.
Hệ gen ty thể (mitochodrial genome), một bộ phận quan trọng của tế bào, có dạng hình gậy hoặc hình hạt. Dưới kính hiển vi điện tử, người ta thấy ty thể là bộ phận có tổ chức cao. Ty thể có hai màng phân biệt rõ rệt: màng ngoài nhẵn, bao quanh ty thể, màng trong có từng đoạn có nếp gấp chạy vào trung tâm làm thành những mào (cristae). Khoang ở trung tâm gọi là chất cơ bản. Kích thước thay đổi tuỳ loại tế bào. Trong một tế bào có 200 – 300 ty thể hoạt động. Hệ gen ty thể (mitochondrial genome) là một thực thể chứa ADN hai sợi khép kín, định vị trong ty thể nằm trong nguyên sinh chất tế bào. Ty thể (mitochondrion) là một bộ phận của tế bào, chứa một hệ gen riêng gồm các gen sản xuất sản phẩm (enzym) tham gia quá trình ôxy hoá-khử, giải phóng năng lượng (dưới dạng ATP) cho tế bào hoạt động. Hệ gen ty thể có độ dài khoảng 13-25 nghìn nucleotid, chứa 12-13 gen cho sản phẩm protein. Ngoài ra còn có 2 gen ARN ribôxôm, 22 gen của ARN vận chuyển và một phần không gen chưa rõ chức năng, dài ngắn tuỳ thuộc loài động vật.
Hướng sử dụng hệ gen ty thể trong nghiên cứu quan hệ loài và phả hệ được coi là có cơ sở vững vàng nhất trong điều kiện hiện nay. Do có kích thước nhỏ, lại chứa gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào nên ADN hệ gen ty thể được