Ứng dụng công nghệ gen trong xác định thành phần loài sán dây thường gặp ở Việt Nam

Sán dây thường gặp ở Việt Nam bao gồm sán dây bò và sán dây lợn, sán dây/ấu trùng sán lợn phân bố ở ít nhất 50 tỉnh. Các mẫu sán dây thu thập từ 14 tỉnh và ấu trùng của chúng thu thập từ 9 tỉnh ở cả 3 miền trong cả nước để xác định thành phần loài bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng hệ gen ty thể cob (cytocrome b) và coxl (cytochrome c oxidase subunit 1), so sánh với các chủng đã biết trên thế giới. Kết quả đã xác định các loài sán dây ký sinh trên người như loài sán dây Châu Á Taenia asiatica đầu tiên ở Việt Nam; thẩm định sán dây bò là Taenia saginata; sán dây lợn là Taenia solium; ấu trùng sán dây lợn trên nguời và lợn là (Taenia solium).
1.    ĐẶT VẤN ĐỂ
Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới, có trên 40 triệu người nhiễm sán lá truyền qua thức ăn và hơn 100 triệu người nhiễm sán dây/ấu trùng sán lợn, phân bố ở nhiều nước, đặc biệt ở các nước nhiệt đới.
Trong 10 năm gần đây và hiện nay, phương pháp sinh học phân tử dựa vào kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) sử dụng chỉ thị di truyền hệ gen nhân và hệ gen ty thể đang được ứng dụng rông rãi và có đô tin cậy cao, đặc biệt được coi là rất có hiệu quả trong giám định và phân loại ký sinh trùng (Cupolillo và cs, 1994; Degrave và cs, 1994; Wilson, 1995; Aransay và cs, 2000; Reithinger và cs, 2000, De Andrade và cs, 2001 Salotra và cs, 2001).
Tại Việt Nam, bệnh sán lá, sán dây phổ biến hầu khắp trong cả nước như sán lá gan nhỏ (Clonorchis và Opisthorchis) lưu hành ở ít nhất 24 tỉnh với tỷ lệ nhiễm có nơi 37-40% (Nam Định, Hà Tây, Thanh Hoá, Phú Yên); sán lá gan lớn (Fasciola) lưu hành ở ít nhất 47 tỉnh, có nơi tỷ lệ nhiễm 11,1% (Khánh Hoà); sán lá phổi (Paragonimus) lưu hành ở ít nhất 10 tỉnh, có nơi tỷ lệ nhiễm 15% (Sơn La); sán dây/ấu trùng sán lợn (Taenia/Cysticercosis) lưu hành ở ít nhất 50 tỉnh, có nơi tỷ lệ nhiễm sán dây 12% và nhiễm ấu trùng sán lợn 5,7% (Bắc Ninh)…
Từ trước đến nay, việc xác định thành phần loài giun sán ở Việt Nam thường dựa vào đặc điểm hình thái học (Morphology). Vấn đề định loại bằng hình thái học đã đóng góp to lớn vào việc xác định thành phần loài ký sinh trùng, song vẫn còn những hạn chế nhất định và chính phân loại bằng sinh học phân tử sẽ khắc phục được những khiếm khuyết đó. Đặc biệt sán dây có hình thái tương tự sán dây bò nhưng vật chủ trung gian lại chủ yếu là lợn, đó là sán dây châu Á, có tác giả còn cho là dưới loài của nhau và ấu trùng của nó có ký sinh trên người hay không, cũng chưa ai xác định được. Sán dây châu Á đã được xác định ở Đài Loan, Hàn Quốc, nhưng ở Việt Nam, chưa ai xác định.
Do vậy, việc ứng dụng công nghê gen (nghiên cứu sinh học phân tử) đối với các loài giun sán nói riêng và ký sinh trùng nói chung là hết sức cần thiết ở nước ta hiện nay. Mục tiêu nghiên cứu đề tài này là: Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử (kỹ thuật PCR) để xác định thành phần loài của sán dây và ấu trùng của nó ở Việt Nam.
2.    PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1.    Thu thập mẫu
2.1.1.    Cách thu thập mẫu: đốt sán dây được thu thập từ bệnh nhân bằng đãi phân khi điều trị đặc hiệu; ấu trùng sán lợn được thu thập bằng sinh thiết trên bệnh nhân.
2.1.2.    Các địa phương thu mẫu:
Các mẫu sán dây được thu thập tại: Bắc Ninh, Hà Tây, Thái Nguyên, Thanh Hoá, Thái Bình, Hoà Bình, Hà Tĩnh, Thừa Thiên- Huế, Phú Yên, Đắc Lắc, Kon Tum, Lâm Đổng, TP.HỔ Chí Minh, Cần Thơ.
Các mẫu ấu trùng sán lợn được thu thập trên bệnh nhân từ: Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Tây, Thái Bình, Hải Phòng, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Thái Nguyên và Bắc Kạn.
2.2.    Bảo quản mẫu:
•    Mẫu sán được rửa sạch bằng nước muối sinh lý.
•    Mẫu được cố định trong cổn 70% và bảo quản lạnh – 20°C, cho đến khi sử dụng.
2.3.    Các bước tiến hành kỹ thuật:
–    Tách chiết ADN từ mẫu nghiên cứu:
ADN tổng số được tách chiết bằng bô hoá chất Genomic-Tip Kit hoặc ADNeasy (QIAGEN Inc.) theo qui trình của nhà sản xuất. Mô tả rút gọn như sau: mẫu vật bảo quản trong cổn 70% được lấy ra và cho cổn bay hơi hết trong ly tâm chân không, sau đó rửa nhiều lần trong PBS. Mẫu vật được nghiền kỹ và xử lý với các dung môi của Kit, rổi hấp phụ lên màng và ly chiết ADN theo qui trình tách chiết. Hàm lượng ADN sử dụng là khoảng 100-150 nanogram cho mỗi phản ứng PCR có dung lượng 50 microlit.
–    Chọn mồi cho phản ứng PCR
Gen coxl (cytochrome oxidase 1) hoặc gen cob (cytochrome oxidase b) hoặc nad1 (nicotinamide dehydrogenase subunit 1) là gen ty thể được chọn làm đích nghiên cứu. Cặp mổi (primer) dùng trong nhân bản ADN đích bằng phản ứng PCR được chọn trên cơ sở các trình tự bảo tổn của gen này có trong Ngân hàng Gen hoặc trên các tài liệu đã xuất bản. Trong môt số trường hợp cần thiết có thể chọn những gen khác đã có trong Ngân hàng gen như vùng giao gen ỈTS-2(internal transcribed spacer 2) của hệ gen nhân như đối với sán lá gan lớn Fasciola hoặc gen 18S ribosome như đối với sán lá ruôt lớn Fasciolopsis, 18S ribosome và ĨTS-2 đối với sán lá ruôt nhỏ Haplorchis làm chỉ thị di truyền trong nghiên cứu.