Ứng dụng công nghệ gen trong xác định thành phần loài sán lá, sán dây thường gặp ở Việt Nam

Sán lá, sán dây thường gặp ở Việt Nam bao gồm sán lá gan nhỏ lưu hành ở ít nhất 24 tỉnh, sán lá gan lớn ít nhất ở 47 tỉnh, sán lá ruột lớn ít nhất 16 tỉnh, sán lá ruột nhỏ ở ít nhất 15 tỉnh, sán lá phổi ở ít nhất 10 tỉnh, sán dây/ấu trùng sán lợn ở ít nhất 50 tỉnh. Các mẫu sán lá, sán dây và ấu trùng của chúng được thu thập từ 33 tỉnh ở cả 3 miền trong cả nước để xác định thành phần loài bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng hệ gen ty thể (cob, cox, nadl) hoặc/và phần giao gen (ITS-2) và 18S Ribosome của hệ gen nhân so sánh với các chủng đã biết trên thế giới. Kết quả đã xác định loài sán dây Châu Ả Taenia asiatica đầu tiên ở Việt Nam; thẩm định sán dây bò là Taenia saginata; sán dây lợn là Taenia solium; ấu trùng sán dây lợn trên nguời và lợn là (Taenia solium), loài sán lá phổi là Paragonimus heterotremus; loài sán lá gan lớn là Fasciola gigantica (có lai với F. hepatica); loài sán lá gan nhỏ ở miền Bắc là Clonorchis sinensis; loài sán lá gan nhỏ ở miền Nam là Opisthorchis viverrini; loài sán lá ruột lớn trên người là Fasciolopsis buski; loài sán lá ruột nhỏ trên người là Haplorchis taichui và H.pumilio.
1. ĐẶT VẤN ĐỂ
Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới, có trên 40 triệu người nhiễm sán lá truyền qua thức ăn và hơn 100 triệu người nhiễm sán dây/ấu trùng sán lợn, phân bố ở nhiều nước, đặc biệt ở các nước nhiệt đới.
Trong 10 năm gần đây và hiện nay, phương pháp sinh học phân tử dựa vào kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) sử dụng chỉ thị di truyền hệ gen nhân và hệ gen ty thể đang được ứng dụng rộng rãi và có độ tin cậy cao, đặc biệt được coi là rất có hiệu quả trong giám định và phân loại ký sinh trùng (Cupolillo và cs, 1994; Degrave và cs, 1994; Wilson, 1995; Aransay và cs, 2000; Reithinger và cs, 2000, De Andrade và cs, 2001 Salotra và cs, 2001).
Tại Việt Nam, bệnh sán lá, sán dây phổ biến hầu khắp trong cả nước như sán lá gan nhỏ (Clonorchis và Opisthorchis) lưu hành ở ít nhất 24 tỉnh với tỷ lệ nhiễm có nơi 37-40% (Nam Định, Hà Tây, Thanh Hoá, Phú Yên); sán lá gan lớn (Fasciola) lưu hành ở ít nhất 47 tỉnh, có nơi tỷ lệ nhiễm 11,1% (Khánh Hoà); sán lá phổi (Paragonimus) lưu hành ở ít nhất 10 tỉnh, có nơi tỷ lệ nhiễm 15% (Sơn La); sán dây/ấu trùng sán lợn (Taenia/Cysticercosis) lưu hành ở ít nhất 50 tỉnh, có nơi tỷ lệ nhiễm sán dây 12% và nhiễm ấu trùng sán lợn 5,7% (Bắc Ninh)…
Từ trước đến nay, việc xác định thành phần loài giun sán ở Việt Nam thường dựa vào đặc điểm hình thái học (Morphology). Vấn đề định loại bằng hình thái học đã đóng góp to lớn vào việc xác định thành phần loài ký sinh trùng, song vẫn còn những hạn chế nhất định và chính phân loại bằng sinh học phân tử sẽ khắc phục được những khiếm khuyết đó.
Do vậy, việc ứng dụng công nghệ gen (nghiên cứu sinh học phân tử) đối với các loài giun sán nói riêng và ký sinh trùng nói chung là hết sức cần thiết ở nước ta hiện nay. Mục tiêu nghiên cứu đề tài này là: Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử (kỹ thuật PCR) để xác định thành phần loài của một số loài sán lá, sán dây thường gặp ở Việt Nam.
Ninh Bình, Nghê An, Thừa Thiên- Huế, Cần Thơ và An Giang; sán lá ruột nhỏ tại Yên Bái, Quảng Ninh, Nam Định, Ninh Bình, Thừa Thiên Huế, Lâm Đổng; sán dây tại: Bắc Ninh, Hà Tây, Thái Nguyên, Thanh Hoá, Thái Bình, Hoà Bình, Hà Tĩnh, Thừa Thiên- Huế, Phú Yên,
Đắc Lắc, Kon Tum, Lâm Đổng, TP.Hổ Chí Minh, Cần Thơ; ấu trùng sán lợn bằng sinh thiết trên bênh nhân từ: Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Tây, Thái Bình, Hải Phòng, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Thái Nguyên và Bắc Kạn.
2.1.2.    Thu mẫu từ vật chủ trung gian: ấu trùng sán lá gan từ cá tại Hà Nội, Nam Định; ấu trùng sán lá ruột nhỏ tại Nam Định, Ninh Bình; ấu trùng sán lá phổi thu thập từ cua tại Hoà Bình,
Sơn La, Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái theo phương pháp tiêu cơ bằng pepsin acid.
2.2.    Bảo quản mẫu:
•    Mẫu sán được rửa sạch bằng nước muối sinh lý.
•    Mẫu được cố định trong cổn 70% và bảo quản lạnh – 20°C, cho đến khi sử dụng.
2.3.    Các bước tiến hành kỹ thuật:
–    Tách chiết ADN từ mẫu nghiên cứu:
ADN tổng số được tách chiết bằng bộ hoá chất Genomic-Tip Kit hoặc ADNeasy (QIAGEN Inc.) theo qui trình của nhà sản xuất. Mô tả rút gọn như sau: mẫu vật bảo quản trong cổn 70% được lấy ra và cho cổn bay hơi hết trong ly tâm chân không, sau đó rửa nhiều lần trong PBS. Mẫu vật được nghiền kỹ và xử lý với các dung môi của Kit, rổi hấp phụ lên màng và ly chiết ADN theo qui trình tách chiết. Hàm lượng ADN sử dụng là khoảng 100-150 nanogram cho mỗi phản ứng PCR có dung lượng 50 microlit.
–    Chọn mồi cho phản ứng PCR
Gen coxl (cytochrome oxidase 1) hoặc gen cob (cytochrome oxidase b) hoặc nadl (Nicotinamide dehydrogenase subunit 1) là gen ty thể được chọn làm đích nghiên cứu. Cặp mổi (primer) dùng trong nhân bản ADN đích bằng phản ứng PCR được chọn trên cơ sở các trình tự bảo tổn của gen này có trong Ngân hàng Gen hoặc trên các tài liêu đã xuất bản. Trong một số trường hợp cần thiết có thể chọn những gen khác đã có trong ngân hàng gen như vùng giao gen lTS-2(internal transcribed spacer 2) của hê gen nhân như đối với sán lá gan lớn Fasciola hoặc gen 18S ribosome như đối với sán lá ruột lớn Fasciolopsis, 18S ribosome và lTS-2 đối với sán lá ruột nhỏ Haplorchis làm chỉ thị di truyền trong nghiên cứu.
–    Quy trình phản ứng PCR
ADN đích đã được nhân bản bằng PCR tiêu chuẩn với bộ hoá chất PCR Master Mix Kit (Promega). Chu trình nhiệt của PCR trên máy Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Inc., Mỹ) gổm các bước như sau: 940C / 5 phút trong 1 chu kỳ; tiếp theo là 35 chu kỳ ở 940C / 1 phút, 500C /1 phút và 720C /1 phút; chu kỳ cuối kéo dài 10 phút ở 720C. Sản phẩm PCR được tinh chế bằng bộ hoá chất QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.) và được dòng hoá vào vector có tên gọi là pCR2.1 hoặc pCR 2.1 (TOPO) của bộ hoá chất TA-cloning Kit (Invitrogen Inc.). Vector pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR được chuyển nạp vào dòng tế bào IVNaF’ và chọn lọc khuẩn lạc theo phương pháp kháng sinh và chỉ thị màu (Sambrook và Russell, 2001). ADN của plasmid có chứa sản phẩm PCR cần nghiên cứu được tách chiết với bộ hoá chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit (QIAGEN Inc.).
Trình tự nucleotid của ADN trong plasmid chứa sản phẩm PCR tái tổ hợp được giải trình trên máy tự động ABI 377 (ABI 377 automated sequencer) của hãng Perkin-Elmer (Mỹ). Chuỗi nucleotid được xử lý bằng chương trình SeqEd1.3; sau đó so sánh sử dụng chương trình AsemblyLIGN 1.9 và MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.). Trong phân tích phả hê, tất cả các chuỗi của các chủng chọn lọc trong đó có các chủng của Viêt Nam được sắp xếp theo chương trình GENDOC 2.5, sau đó được đưa vào phân tích phả hê bằng chương trình MEGA 2.1 về thành phần nucleotid và acid amin, sử dụng hệ số tiến hoá thấp ME (minimum evolution index) (Kuma và cs, 2001).
2.4.    Phương pháp xử lý nucleotid/ chuỗi acid amin và ứng dụng sinh-tin học xử lý kết quả
Giải trình nucleotid trực tiếp hoặc sau khi dòng hoá, từ ADN của plasmid tái tổ hợp, được thực hiện bằng máy giải trình tự động (ABI377 automated sequencer), xử lý bằng các phần mềm được cung cấp là SeqEd 1.0.3; AssemblyLIGN 1.0.9c nhằm thu nhận chuỗi chung, sau đó xử lý bằng hệ chương trình MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Group). Giám định chuỗi ADN (gen chẩn đoán) bằng truy nhập Ngân hàng Gen (Gen Bank) bằng chương trình