Ứng dụng kĩ thuật multiplex ligation-dependent probe amplification (mlpa) xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin

Đặt vấn đề: Bệnh loạn dưỡng cơ Duchene (Duchenne Muscular Dystrophy- DMD) gây nên bởi đột biến gen dystrophin, trong đó đột biến xóa đoạn gen chiếm tỉ lệ cao nhất: 60-65%. Tại Việt Nam, những kĩ thuật sinh học phân tử thường qui để phát hiện đột biến xóa đoạn trên gen dystrophin bao gồm: PCR, RT-PCR & Multiplex PCR, Southern blots…;    những    kĩ    thuật    này đòi hỏi    thời    gian dài (3- 4    tuần).    Trên    thế giới,    kĩ
thuật MLPA với ưu thế thời gian phát hiện đột biến nhanh (1 tuần) và độ chính xác cao đang được áp dụng rộng rãi trong việc chẩn đoán bệnh DMD và các bệnh lí di truyền khác. Mục tiêu:    Ứng    dụng    kĩ    thuật    MLPA xác    định    đột biến    xóa    đoạn gen dystrophin.
Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu được thực hiện trên 6 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh DMD dựa trên tiêu chuẩn lâm sàng và cận lâm sàng, sử dụng kĩ thuật MLPA để xác định đột biến gen. Kết quả: Phát hiện 3 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn gen dystrophin, trong đó một bệnh nhân bị đột biến xóa đoạn gen nằm ngoài vùng “hot-spot”. Kết luận: Ứng dụng thành công kỹ thuật MLPA xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân DMD.
I.    ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong số các bệnh lý di truyền, Duchene Muscular Dystrophy (DMD) là một bệnh di truyền tiên lượng nặng; bệnh nhân thường bị tàn phế, mất khả năng đi lại và chết trước tuổi trưởng    thành.    Tần    suất    mắc    là 1/3500    trẻ    trai.    Bệnh    gây nên    bởi    đột    biến    gen
dystrophin. Gen dystrophin có chiều dài khoảng 2400 kb gồm 79 exon, một trong những gen lớn nhất của loài người được phát hiện cho đến nay. Dạng đột biến thường gặp nhất của gen dystrophin là đột biến xóa đoạn, chiếm tỉ lệ khoảng 60- 65% [3]. Xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin có thể tiến hành ở 2 mức độ: mức độ DNA và mức độ RNA. Ở mức độ DNA, để xác định đầy đủ các đột biến xóa đoạn trên toàn bộ 79 exon, các tác giả phải khuếch đại 79 exon bằng 79 cặp mồi đặc hiệu để xác định đột biến, công việc này tốn kém nhiều về tài chính và thời gian. Do vậy, các tác giả thường chỉ sử dụng 19- 25 cặp mồi đặc hiệu bao phủ 2 vùng trọng điểm (hot-spot) là vùng trung tâm ở giữa gen (exon 43 ^ 60) và vùng tận cùng đầu 5’ (exon 1 ^ 19) [1][2][4][6]. Tuy nhiên đột biến gen dystrophin có thể nằm rải rác trên 79 exon, vì thế các đột biến gen thường bị bỏ xót. Ở mức độ RNA, việc sử dụng 15 cặp mồi đặc hiệu có thể khuếch đại toàn bộ mRNA chứa 79 exon do các intron đã được cắt bỏ trong quá trình hoàn thiện mRNA. Quá trình xác định đột biến của gen dystrophin phải tiến hành nhiều bước: phản ứng RT-PCR, phản ứng Nested – PCR, kĩ thuật nhân dòng và giải trình tự gen với thời gian từ 3 đến 4 tuần [5]. Ngày nay trên thế giới, kĩ thuật MLPA được uư tiên chọn lựa trong việc chẩn đoán đột biến xóa đoạn gen dystrophin. Với 2 phản ứng PCR, đột biến gen dystrophin sẽ được khảo sát đầy đủ trong vòng 1 tuần. Xuất phát từ thực tế trên, đề tài nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu:
Ứng dụng kĩ thuật MLPA để chẩn đoán đột biến xóa đoạn gen dystrophin trong bệnh DMD.
II.    ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Đối tượng nghiên cứu
–     Nhóm chứng: 6 người nam bình thường khỏe mạnh, được lấy ngẫu nhiên từ cộng đồng.
–    Nhóm nghiên cứu: 6 bệnh nhân nam đã được chẩn đoán mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne dựa vào các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình. Sáu bệnh nhân được đánh số theo mã số M01, M02, M03, M04, M05, M06.
2.    Phương pháp nghiên cứu
2.1    Kĩ thuật tách chiết DNA
DNA được tách chiết từ bạch cầu máu ngoại vi theo qui trình phenol/chloroform. Các mẫu DNA được tiến hành đo nồng độ và độ tinh sạch trên máy nanodrop, những mẫu DNA đạt giá trị OD28O/OD26O > 1.8 được sử dụng để phân tích.
2.2    Kĩ thuật MLPA xác định đột biến xóa đoạn trên gen dystrophin
* Nguyên tắc kĩ thuật: Sử dụng các đoạn dò DNA (probe) có khả năng lai với phân tử DNA đích đặc hiệu. Mỗi probe gồm hai chuỗi oligonucleotid dài và ngắn. Mỗi chuỗi gồm: đoạn gắn mồi (đoạn 1), đoạn đặc hiệu với DNA đích (đoạn 2), và ở chuỗi dài có thêm đoạn đệm (đoạn 3).