Ứng dụng kĩ thuật Reverse Dot Blot để xác định genotype HPV trong dịch cổ tử cung
Luận văn Ứng dụng kĩ thuật Reverse Dot Blot để xác định genotype HPV trong dịch cổ tử cung.Human papilloma virus (HPV) là loại virus sinh u nhú ở người, là một trong những tác nhân lây nhiễm qua đường sinh dục phổ biến. Nhiễm HPV ở người thường gây ra các trạng thái tăng sinh nội biểu mô ở nhiều dạng khác nhau. Dựa vào khả năng tiềm tàng gây ung thư, HPV được chia thành 2 nhóm: nhóm nguy cơ cao và nhóm nguy cơ thấp, đặc biệt nhóm nguy cơ cao có thể biểu hiện thành các khối u điển hình như ung thư cổ tử cung (UTCTC), u biểu mô vùng hậu môn – sinh dục (âm hộ – âm đạo, vùng trực tràng, hậu môn, dương vật) và các khối u ở vòm họng, hầu họng [1]. Trong đó, UTCTC là một trong những loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên thế giới và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu của phụ nữ ở các nước đang phát triển. Do đó, việc phòng bệnh cũng như điều trị UTCTC ngày càng được quan tâm [2], [3].
HPV được phát hiện ở trên 95% số trường hợp mắc UTCTC [4]. Khả năng diễn tiến đến UTCTC ở trường hợp nhiễm HPV kéo dài gấp 250 lần so với người không bị nhiễm [5]. Trên toàn thế giới, có khoảng 50 ^ 80% phụ nữ có quan hệ tình dục bị nhiễm HPV ít nhất một lần trong đời, nhưng bệnh ít được biết đến vì sự nhiễm bệnh hầu như không gây ra triệu chứng lâm sàng đáng phải quan tâm [6], [7]. Quá trình nhiễm virus là lâu dài, trung bình từ giai đoạn loạn sản (giai đoạn tổn thương có thể hồi phục) đến giai đoạn ung thư xâm nhập (việc điều trị đem lại ít hiệu quả) là từ 8 ^ 10 năm [8]. Vì vậy, sàng lọc trong nhóm nguy cơ cao để phát hiện và điều trị ở giai đoạn sớm tổn thương tiền ung thư là hết sức cần thiết.
Việc xác định các genotype HPV (type HPV) có vai trò vô cùng quan trọng trong việc đánh giá nguy cơ UTCTC cũng như điều trị sớm.
Có nhiều phương pháp phát hiện sớm sự có mặt của HPV. Phương pháp PAP smear (xét nghiệm tế bào học cổ tử cung) cho biết sự thay đổi hình thái tế bào bị nhiễm HPV, có tỉ lệ âm tính giả dao động từ 1,1 ^ 29,7% [8], tuy nhiên không xác định được type HPV [9]. Phương pháp Ts – PCR (Type specific – PCR) phải qua bước phát hiện sản phẩm PCR, điện di agarose sử dụng Ethidium bromide. Phương pháp sequencing (giải trình tự gen – so sánh, đối chiếu với trình tự gen các type HPV) được coi là tiêu chuẩn vàng nhưng giá thành cao, tốn nhiều thời gian và không xác định được đồng nhiễm. Kĩ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (RDB) sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phân biệt sự khác nhau giữa các alen ở vị trí một nucleotide (Nu). So với các kĩ thuật trên, kĩ thuật Reverse Dot Blot đã khắc phục được một số nhược điểm, đồng thời có thể xác định sự nhiễm và đồng nhiễm các type HPV trên cùng một mẫu bệnh phẩm. Song ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về kĩ thuật này được thực hiện.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng kĩ thuật Reverse Dot Blot để xác định genotype HPV trong dịch cổ tử cung”
với mục tiêu:
1. Phân tích được kết quả xác định genotype HPV bằng kĩ thuật Reverse Dot Blot.
2. Mô tả các genotype HPV trong dịch cổ tử cung xác định được bằng kĩ thuật Reverse Dot Blot.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Ứng dụng kĩ thuật Reverse Dot Blot để xác định genotype HPV trong dịch cổ tử cung
1. Bosch F.X. and Munoz N. (2002). The viral etiology of cervical cancer.
Virus Research, 89, 183 – 190.
2. Phạm Thị Hoàng Anh, Nguyễn Mạnh Quốc, Nguyễn Bá Đức và cộng sự. (2001). Tình hình bệnh ung thư ở Việt Nam năm 2000. Tạp chí thông tin
Y dược, 2, 3 – 11.
3. Trịnh Quang Diện. (1995). Phát hiện các dị sản, loạn sản và ung thư cổ tử cung bằng phương pháp tế bào học, trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội.
4. Franco E.L., Duarte – Franco et al. (2001). Epidemiology, prevention and the role of human papillomavirus infection. Canadian Medical Association Journal.
5. Munoz N. et al. (2002). Role or parity and human papillomavirus in cervical cancer. Lancet Journal, 359 (9312), 1093 – 1101.
6. Koutsky L. et al. (1997). Epidemiology of genital human papillomavirus infection. American Journal of Medicine, 102, 3 – 8.
7. Crum C.P., Abbott D.W. et al. (2003). Cervical cancer screening: from the papanicolaou smear to the vaccine era. Journal of Clinical Oncology, 21 (10), 224 – 230.
8. Trịnh Quang Diện. (2002). Theo dõi bằng tế bào học và mô bệnh học các tế bào vảy không điển hình ý nghĩa chưa xác định (ASCUS) gặp trong phát hiện tế bào học các tổn thương nội biểu mô và ung thư cổ tử cung.
Tạp chí Y học thực hành, 431, 266 – 269.
9. Vương Tiến Hòa. (2004). Một số vấn đề bệnh lí cổ tử cung, Nhà xuất bản
Y học, Hà Nội.
10. Lê Đức Trình. (2001). Sinh học phân tử và công nghệ gen, Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội.
11. Chan S.Y., Delius H., Halpem A.L. et al. (1995). Analysis of genomic sequences of 95 papillomavirus types uniting typing, phylogeny, and taxonomy. Journal of Virology, 69, 3074 – 3083.
12. Chan S.Y., Bernard H.U., Ratteree M. et al. (1997). Genomic diversity and evolution of papillomaviruses in rhesus monkeys. Journal of Virology, 71, 4938 – 4943.
13. Torrisi A., Del M.A., Onnis G.L. et al. (2000). Colposcopy, cytology and HPV testing in HIV – positive and HIV – negative women. European Journal of Gynecology Oncology, 21, 168 – 172.
14. Nguyễn Thị Ánh Hồng. (2005). Sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử phát hiện virus gây ung thư cổ tử cung (HPV) ở một số bệnh nhân tại Hà Nội, trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội.
15. Munoz N., Bosch F.X., de Sanjose’ S. et al. (2003). Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. New England Journal of Medicine, 348, 518 – 527.
16. Burd E.M. (2003). Human papillomavirus and cervical cancer. Clinical Microbiology Review, 16 (1), 1 – 17.
17. Ethel – Michele de Villers, Claude Fauquet et al. (2004). Classification of papillomaviruses. Virology, 324, 17 – 27.
18. Thomas M., Pim D. and Banks L. (1999). The role of the E6 – p53 interaction in the molecular pathogenesis of HPV. Oncogene, 18, 7690 – 7700.
19. Bộ môn Phụ sản, trường Đại học Y Hà Nội. (2003). Ung thư cổ tử cung – phát hiện sớm ung thư cổ tử cung bằng phiến đồ âm đạo. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
20. Boccardo E., Lepique A.P., Villa L.L. (2010). The role of inflammation in HPV carcinogenesis. Carcinogenesis, 31 (11), 1905 – 1912.
21. Buitrago – Pérez A. (2009). Molecular Signature of HPV – Induced Carcinogenesis: pRb, p53 and Gene Expression Profiling. Current genomic, 10 (1), 26 – 34.
22. Hebner C.M., Laimins L. (2006). Human papillomaviruses: basic mechanisms of pathogenesis and oncogenicity. Reviews in medical virology, 16 (2), 83 – 97.
23. Lehoux M. (2009). Molecular Mechanisms of HPV – induced Carcinogenesis. Carcinogenesis, 90, 432- 465.
24. Anco M., Berhard K., Win Q. et al. (2005). Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections. Journal of Clinical Virology, 32, 43 – 51.
25. Moody C., Laimins L. (2010). Human papillomavirus oncoproteins: pathways to transformation. Nature reviews Cancer, 10 (8), 550 – 560.
26. Zur H. H. (1996). Papillomavirus infections – a major cause of human cancers. Biochimica et Biophysica Acta, 1288, 55 – 78.
27. Franceschi S. et al. (2011). Human papillomavirus type distribution in 30,848 invasive cervical cancers worldwide: Variation by geographical region, histological type and year of publication. International journal of cancer, 128(4), 927-935.
28. Bosch F.X., Lorincz A., Munoz N. et al. (2002). The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. Journal of Clinical Pathology, 55, 244 – 265.
29. Hoàng Thị Thanh Huyền, Tạ Thành Văn. (2011). Human papilloma Virus và ung thư cổ tử cung ở gái mại dâm miền Bắc Việt Nam. Tạp chíy học
Việt Nam, 386, 363 – 367.
30. Kohli M., Lawrence D., Haig J. et al. (2012). Modeling the impact of the difference in cross – protection data between a human papillomavirus (HPV) – 16/18 AS04 – adjuvanted vaccine and a human papillomavirus (HPV) – 6/11/16/18 vaccine in Canada. BMC public health, 12(1), 872.
31. Petrosky E. et al. (2015). Use of 9-Valent Human Papillomavirus (HPV) Vaccine: Updated HPV Vaccination Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Weekly, 64 (11), 300 – 304.
32. King E.M., Gilson R. et al. (2015). Human papillomavirus DNA in men who have sex with men: type-specific prevalence, risk factors and implications for vaccination strategies. British journal of cancer, 112(9), 1585-1593.
33. Ronco G. et al. (2010). Efficacy of Human Papilloma Virus testing for the detetection of invasive cervical cancers and cervical intraepithelial neoplasia: a randomized controlled trial. Lancet Oncology, 11, 249 – 257.
34. Lauren E.W., Michael P. et al. (2013). Natural immune responses against eight oncogenic Human Papilloma Virus in the ASCUS – LSIL triage study. International Journal of Cancer, 133 (9), 2172 – 2181.
35. Clifford G. et al. (2006). Chapter 3: HPV type – distribution in women with and without cervical neoplastic diseases. Vaccine, 24 (3), 26 – 34.
36. Vũ Thị Nhung. (2006). Khảo sát tình hình nhiễm các type HPV (Human Papilloma Virus) ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh bằng kĩ thuật sinh học phân tử. Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí minh, phụ bản chuyên đề Ung bướu học, 10 (4), 402 – 407.
37. Lê Trung Thọ và Trần Văn Hợp. (2009). Nghiên cứu tỉ lệ nhiễm HPV ở cộng đồng phụ nữ Hà Nội và một số yếu tố liên quan. Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, 13 (1), 185 – 189.
38. Hoàng Thị Thanh Huyền. (2014). Xác định tỉ lệ nhiễm và genotype của Human Papilloma Virus trên gái mại dâm tại Hải Phòng, Việt Nam, trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội.
39. Nguyễn Trọng Hiếu. (2004). Tần suất nhiễm HPV ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh. Thời sự Y Dược học, 4 (9), 195 – 199.
40. Solomon D., Davey D., Kurman R. et al. (2002). The 2001 Bethesda System: Terminology for reporting results of cervical cytology. Journal of American Medicine Association, 287, 2114 – 2119.
41. Bosch F.X., Manos M.M. et al. (1995). Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer, a worldwide perspective. Journal of National Cancer Institute, 87: 796 – 802.
42. Volpers C. and Steek R.E. (1991). Genome organization and nucleotide sequence of human papillomavirus type 39. Virology, 181: 419 – 423.
43. Walboomers J.M.M., Jacobs M.V. et al. (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. Journal of Pathology, 189: 12 – 19.
44. Trịnh Văn Bảo. (2008). Giáo trình di truyền, trường Đại học Y Hà Nội, nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
45. Phạm Việt Thanh. (2011). Nghiên cứu tỉ lệ nhiễm Human Papilloma Virus ở phụ nữ có phết tế bào cổ tử cung bất thường và các yếu tố liên quan. Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, 15 (1), 158.
46. Nguyễn Sào Trung. (2007). HPV và tổn thương cổ tử cung. Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, 11 (3), 1 – 4.
47. Wentzensen N. et al. (2009). Grading the severity of cervical neoplasia based on combined histopathology, cytopathology, and HPV genotype distribution among 1.700 women reffered to colposcopy in Oklahoma.
Intenational Journal of Cancer, 124, 964 – 969.
LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤCLỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Đặc điểm chung của HPV 3
1.2. Cơ chế gây bệnh 6
1.3. Tình hình nhiễm HPV ở Việt Nam và trên thế giới 9
1.4. Các phương pháp chẩn đoán và xác định genotype HPV 10
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Đối tượng nghiên cứu 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu 16
Chương 3. KẾT QUẢ 27
3.1. Thông tin chung đối tượng nghiên cứu 27
3.2. Phân tích kết quả xác định genotpye HPV 28
3.3. Kết quả xác định genotype HPV trong dịch cổ tử cung 31
Chương 4. BÀN LUẬN 40
4.1. Về kết quả xác định genotype HPV bằng kĩ thuật RDB 40
4.2. Về kết quả xác định genotype HPV 43
KẾT LUẬN 50
KIẾN NGHỊ 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ASCUS Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance (Tổn thương tế bào nội biểu mô vảy không điển hình ý nghĩa chưa xác định)
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
HPV Human Papilloma Virus
HSIL High – grade Squamous Intraepithelial Lesion (Tổn thương tế bào nội biểu mô vảy độ cao)
IARC International Agency for Research on Cancer (Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế)
LSIL Low – grade Squamous Intraepithelial Lesion (Tổn thương tế bào nội biểu mô vảy độ thấp)
Nu Nucleotid
PAP test/PAP smear Papanicolaou Test/Papanicolaou smear (Xét nghiệm tế bào học cổ tử cung)
PCR Polymerase Chain Reaction
PV Papilloma Virus
RDB Reverse Dot Blot (Kĩ thuật lai phân tử ngược)
UTCTC Ung thư cổ tử cung
Bảng 2.1. Trình tự primer MY09 – MY11 của PCR phát hiện DNA HPV 19
Bảng 2.2. Trình tự Nu của 24 probe HPV trên màng lai 24
Bảng 3.1. Phân bố nhóm tuổi 27
Bảng 3.2. Phân bố kết quả PAP test 27
Bảng 3.3. Kết quả định tính HPV bằng kĩ thuật Realtime PCR 31
Bảng 3.4. Phân bố nhiễm đơn type HPV 34
Bảng 3.5. Tỉ lệ đồng nhiễm các type HPV 35
Bảng 3.7. Kết quả PAP test và sự đồng nhiễm HPV 38
Hình 1.1. Hình ảnh mô phỏng HPV 3
Hình 1.2. Hệ gen của HPV 4
Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu 17
Hình 2.2. Kết quả Realtime PCR 20
Hình 2.3. Mẫu dương tính với genotype 11 23
Hình 3.1. Kết quả phân tích Realtime PCR định tính genotype HPV 29
Hình 3.2. Hình ảnh màng lai dương tính với type 11 30
Hình 3.3. Hình ảnh màng lai dương tính với các type 11, 16 và 18 30
Hình 3.4. Hình ảnh màng lai dương tính với type HPV ngoài 24 type trên 31
Hình 3.5. Biểu đồ tỉ lệ nhiễm HPV 32
Hình 3.6. Biểu đồ tỉ lệ nhiễm HPV theo tuổi 33
Hình 3.7. Biểu đồ tỉ lệ nhiễm HPV đơn type và đa type 33
Hình 3.8. Biểu đồ sự đồng nhiễm HPV 34
Hình 3.9. Biểu đồ phân bố các type HPV 36
Hình 3.10. Kết quả PAP test và tỉ lệ nhiễm HPV 37
Hình 4.1. Hình ảnh màng lai dương tính với các type HPV 71, 81, 18, 56 42
Hình 4.2. Hình ảnh màng lai dương tính với type HPV 11
ĐẶT VẤN ĐỀ