ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHUẾCH ĐẠI GEN KHẢO SÁT CÁC TỔ HỢP GIEN THƯỜNG GẶP TRONG BỆNH LÝ BẠCH CẦU CẤP

LUẬN ÁN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHUẾCH ĐẠI GEN KHẢO SÁT CÁC TỔ HỢP GIEN THƯỜNG GẶP TRONG BỆNH LÝ BẠCH CẦU CẤP. Bệnh bạch cầu cấp (BCC) là bệnh lý ác tính của hệ tạo máu được đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương. BCC được chia thành 2 nhóm chính là BCC dòng tủy (BCCDT) và BCC dòng lympho (BCCDL).

Trước đây, việc chẩn đoán và phân loại bệnh bạch cầu cấp hoàn toàn dựa trên hình thái học và nhuộm hóa tế bào theo tiêu chuẩn phân loại của FAB (French –

American – British) [9], [30]. Gần đây, trên thếgiới, việc xác định dấu ấn miễn dịch bằng kỹthuật tếbào dòng chảy (Flow Cytometry) đã được dùng nhằm phân loại các phụnhóm của BCC như: BCC dòng lympho B (BCCDL-B), BCC dòng lympho (BCCDL-T) và BCCDT, đặc biệt là những trường hợp không biệt hóa [23].

Ngày nay, những bất thường vềdi truyền tế bào và vềgien được tìm thấy trong hầu hết các bệnh ung thưmáu. Tếbào bệnh bạch cầu có thểmang những bất thường

nhiễm sắc thể(NST) khác nhau bao gồm những thay đổi vềsốlượng NST nhưtăng

sốlượng bộNST hay giảm sốlượng bộNST, 3 NST và những thay đổi vềcấu trúc NST nhưmất đoạn, đảo đoạn và chuyển đoạn NST.

Trong BCCDT, 4 chuyển vịNST thường gặp là t(8;21), t(15;17), t(9;11) và inv(16)/t(16 ;16) tạo ra 4 kiểu tổhợp gien AML1/ETO [35], [88], PML/RARA [27],, MLL/AF9 [19] vàCBFB/MYH11 [89] tương ứng gặp trong 25-30% bệnh nhân. Bên cạnh đó, trong BCCDL, 4 chuyển vịNST thường gặp là t(1;19), t(4;11), t(12;21) và t(9;22) tạo ra 4 kiểu tổ hợp gien E2A/PBX1 [62], [96], MLL/AF4 [29], [149], TEL/AML1 [72] vàBCR/ABL [80] tương ứng gặp trong 30-35% bệnh nhân.

Sự nhận dạng gien BCR và ABL trong chuyển đoạn t(9;22) tiêu biểu cho bước ngoặc quan trọng khác trong việc thiết lập cơsởdi truyền trong bệnh bạch cầu [124]. Nhiều nghiên cứu sau đó đã xác lập cơsởphân tửcho những bất thường NST đặc trưng trong bệnh bạch cầu. Ngoài việc cung cấp những đầu mối về nguyên nhân bệnh bạch cầu, những tiến bộnhư thếcó ý nghĩa quan trọng trong việc xửtrí bệnh [14].

Có nhiều phương pháp để phát hiện các bất thường về di truy ền tếbào nhưphân tích NST đồ, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH: Fluorescence In Situ Hybridization), lai so sánh bộ gien (CGH: Comparative Genomic Hybridization), SKY (Spectral Karyotyping), M-FISH (Multiplex- Fluorescence In SituHybridization) hoặc CGH microarray, gọi là kỹthuật di truyền tếbào phân tử. Ngoài ra, còn có kỹ thuật khuếch đại gien phiên mã ngược (RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymarase Chain Reaction). Với những ưu điểm như độnhạy cao (có khảnăng phát hiện 1 tếbào ác tính trong 10.000 – 1.000.000 tếbào) [17], [115], [144], phát hiện được những chuyển đoạn NST khó được phát hiện bằng kỹthuật NST đồdo kích thước NST không thay đổi rõ nhưt(12;21)(p13;q22) [121] đồng thời cho kết quả nhanh nên kỹthuật RT-PCR ngày càng trởthành công cụ quan trọng trong chẩn đoán các bất thường vềNST và gien cho bệnh nhân ung thưmáu.

Tại Việt Nam, nhiều nhà khoa học đã thực hiện khá nhiều nghiên cứu vềung thư, từdịch tễcho đến điều trị. Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng kỹthuật di truyền trong phân tích các bất thường NST trong chẩn đoán và điều trịbệnh lý bạch cầu cấp còn rất hạn chế. Trước đây, chỉcó vài báo cáo ứng dụng kỹthuật phân tích di truyền tế bào kinh điển để phát hiện bất thường NST Philadelphia (Ph) trong bệnh BCMDT, nhưng chỉdừng lại ởmức độnghiên cứu trên sốlượng nhỏbệnh nhân, chưa được áp dụng thường qui trong chẩn đoán và theo dõi điều trịbệnh. Từtháng 3 năm 2006, Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học thành phốHồChí Minh (BV. TMHH TP. HCM) đã áp dụng thường qui các kỹthuật sinh học phân tửFISH và RT-PCR trong chẩn đoán, tiên lượng và đặc biệt là theo dõi đáp ứng điều trị, đánh giá bệnh tồn lưu ởmức độphân tử ởbệnh lý bệnh BCMDT, BCCDT và BCCDL. Trong năm 2006, 123 bệnh nhân bệnh bạch cầu được phân tích bằng kỹthuật FISH đểphát hiện các chuyển đoạn t(9;22), t(15;17) và t(8;21) và bằng kỹthuật RT-PCR đểphát hiện các tổhợp gien BCR/ABL, PML/RARAvà AML1/ETOtại Bệnh viện. Trong 2 năm, từ2008 đến 2010, Bệnh viện phối hợp với Đại học Y dược TP. HCM triển khai đềtài cấp Nhà nước chuẩn hóa các kỹthuật di truyền phân tửtrong bệnh lý huyết học.

Việc ứng dụng sinh học phân tử (kỹ thuật RT-PCR, Multiplex PCR, PCR định lượng gien) cho kết quảnhanh chóng hơn so với các kỹthuật di truyền nhưnhiễm sắc thể đồhay FISH, nên đáp ứng kịp thời với nhu cầu chẩn đoán bệnh và chọn lựa phác đồthích hợp. Kỹ thuật có độ nhạy cao, nên rất thích hợp đểtheo dõi điều trị bệnh và đánh giá nguy cơtái phát bệnh. Bên cạnh đó, chúng ta có thểphát hiện nhiều bất thường cùng một lúc, thay vì tốn nhiều thời gian và chi phí cho việc khảo sát từng bất thường nhưtrong kỹthuật FISH, nên phân nhóm tiên lượng bệnh sớm.

Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu tổng quát như sau: “Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gien khảo sát các tổ hợp gien thường gặp trong bệnh lý bạch cầu cấp, góp phần phân loại nhóm tiên lượng bệnh và theo dõi điều trị, tại bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố HồChí Minh, từ ngày 01 tháng 10 năm 2009 đến 31 tháng 7 năm 2011“. Để đạt được kết quảtrên, chúng tôi cần phải thực hiện các mục tiêu chuyên biệt sau:

1. Xác định tỷ lệ của các tổhợp gien thường gặp lúc mới chẩn đoán trong nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng tủy.

2. Xác định tỷlệcủa các tổhợp gien thường gặp lúc mới chẩn đoán trong nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng lympho.

3. Triển khai kỹthuật PCR định lượng theo dõi điều trị

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

1. Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2006). “Triển khai kỹthuật FISH và RT-PCR nhằm phát hiện bất thường nhiễm sắc thể và gen trong bệnh lý huyết học tại bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phốHồChí Minh”. Tạp Chí Y Học Thực Hành, 545: 73-79.

2. Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2007). “Ứng dụng kỹthuật FISH và RT-PCR trong chẩn đoán và điều trịcác bệnh lý huyết học tại bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phốHồChí Minh”. Tạp Chí Y Học Việt Nam, 331: 1-12.

3. Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2008). “Kỹthuật di truyền học tế bào và sinh học phân tửtrong chẩn đoán, tiên lượng và điều trịcác bệnh lý huyết học”. Tạp Chí Y Học Việt Nam, 344: 13-23.

4. Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn ThịKim Định, Phan ThịXinh (2010). “Khảo sát bộ4 tổhợp gen thường gặp trong bạch cầu cấp dòng lympho tại BV Truyền Máu – Huyết Học TP. HCM”. Tạp chí Y học Việt nam, 373: 180-185.

5. Phan Nguyễn Thanh Vân, Phan ThịXinh, Trần ThịTrúc Thanh, Nguyễn Tấn Bỉnh (2011). “Những bất thường nhiễm sắc thểvà gien trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy”. Tạp chí Y học TP. HồChí Minh, 15 (4): 64-71.

6. Phan Nguyễn Thanh Vân, Phan ThịXinh, Trần ThịTrúc Thanh, Nguyễn Tấn Bỉnh (2011). “Những bất thường nhiễm sắc thểvà gien trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho”. Tạp chí Y học TP. HồChí Minh, 15 (4): 72-78.

7. Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh, Nguyễn Thị Kim Định, Phan Thị Xinh (2011). “Xác định 4 tổhợp gien TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1trong bạch cầu cấp dòng lympho tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP. HồChí Minh”. Tạp chí Y học TP. HồChí Minh, 15 (4): 493-497.

8. Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh, Nguyễn Thị Kim Định, Phan Thị Xinh (2011). “Xác định 4 tổ hợp gien AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9trong bạch cầu cấp dòng tủy tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Thành PhốHồChí Minh”. Tạp chí Y học TP. HồChí Minh,

15 (4): 498-502

MỤC LỤC

Trang

Trang phụbìa i

Lời cam đoan ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữviết tắt iv

Danh mục các bảng viii

Danh mục các hình, biểu đồ, sơ đồ xi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1. Di truyền phân tửvà ý nghĩa trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy 4

1.2. Di truyền phân tửvà ý nghĩa trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 17

1.3. Nguyên tắc và ứng dụng của các kỹthuật sinh học phân tử 27

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1. Thiết kếnghiên cứu 35

2.2. Đối tượng nghiên cứu 35

2.3. Phương pháp nghiên cứu 36

2.4. Phân tích sốliệu 51

2.5. Vấn đềy đức 52

Chương 3: KẾT QUẢNGHIÊN CỨU 53

3.1. Đặc điểm chung của quần thểnghiên cứu 53

3.2. Các tổhợp gien lúc mới chẩn đoán 58

3.3. Theo dõi điều trịbằng kỹthuật RT-PCR 71

3.4. Triển khai kỹthuật PCR định lượng theo dõi điều trị 72

Chương 4: BÀN LUẬN 84

4.1. Đặc điểm chung của quần thểnghiên cứu 84

4.2. Các tổhợp gien lúc mới chẩn đoán 86

4.3. Theo dõi điều trịbằng kỹthuật RT-PCR 95

4.4. Triển khai kỹthuật PCR định lượng theo dõi điều trị 98

4.5. Ưu điểm và hạn chếcủa nghiên cứu 103

KẾT LUẬN 105

KIẾN NGHỊ 106

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ xii

TÀI LIỆU THAM KHẢO xiii

PHỤLỤC xxviii