Ứng dụng kỹ thuật Multiplex Ligation-Dependent probe Aplification (mlpa) xác định ðột biến xóa đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne

Gen  dystrophin  nằm  ở  vị  trí  Xp21  trên nhiễm sắc thể X, chiều dài hơn 2400 Kb, mã hóa 14-kb mRNA, là gen người dài nhất ñược biết cho ñến nay. Gen dystrophin tổng hợp nên protein dystrophin, một protein ñóng vai trò quan trọng ñể bảo vệ cơ trong quá trình co cơ. ðột biến gen dystrophin dẫn ñến sự mất toàn vẹn của protein dystrophin, gây nên bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy – DMD). DMD là một trong những bệnh lý về cơ do di truyền thường gặp nhất, có tần suất mắc bệnh vào khoảng 1/3.500 trẻ trai. DMD là bệnh cơ rất nặng với biểu hiện lâm sàng mang tính chất tuần tiến, trẻ bị teo cơ, mất khả năng ñi lại và chết trước tuổi trưởng thành do suy tim và rối loạn hô hấp. Xác ñịnh vị trí  ñột  biến  gen  dystrophin  cho  bệnh  nhân DMD là bước ñầu tiên quan trọng ñể chẩn ñoán trước sinh, tư vấn di truyền và là chỉ ñiểm cho liệu pháp gen bệnh DMD trong tương lai. Trong các dạng ñột biến gen dystrophin, ñột biến xóa ñoạn chiếm tỷ lệ cao nhất (60-65%) [2]. Có nhiều phương pháp xác ñịnh ñột biến xóa ñoạn gen này song vì gen dystrophin quá lớn với 79 exon, nên các phương pháp kinh ñiển  thường  bị  hạn  chế  về  mặt  thời  gian. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) là kỹ thuật chẩn ñoán ñột biến xóa ñoạn và lặp ñoạn nhanh chóng, chính xác, ñang ñược ứng dụng rộng rãi [5, 6]. ðề tài ñược tiến hành với mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật MLPA xác ñịnh ñôt biến xóa ñoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne.
II.    ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1.    Đối tượng nghiên cứu
13 bệnh nhân ñược chẩn ñoán bệnh DMD tại Khoa Nội tiết, Chuyển hoá, Di truyền- bệnh viện Nhi Trung ương dựa vào các dấu hiệu lâm sàng và cận lâm sàng ñiển hình: bệnh nhân có dấu hiệu yếu cơ, ñi lại hay vấp ngã, phì ñại cơ cẳng chân, dấu hiệu Gower dương tính, hoạt ñộ enzym Creatine Kinase (CK) tăng cao trong máu 12.000 UI/l (bình thường 200
UI/l). 01 người bình thường làm mẫu chứng ñi kèm với mẫu bệnh nhân trong mỗi phản ứng.
2.    Phương pháp nghiên cứu
–    Quy trình lay mau: 2ml máu tĩnh  mạch chống ñông EDTA, ñảm bảo tuyệt ñối vô trùng.
–    Quy trình tách chiet DNA tong so: theo quy trình phenol/chloroform [3]. Nồng ñộ và ñộ tinh sạch DNA ñược kiểm tra bằng phương pháp quang phổ (OD 260/280).
–    Quy trình kỹ thuật MLPA xác ñịnh ñột biến xóa ñoạn gen:
+  Nguyên lý:  Sử  dụng  79  ñoạn  dò  gen dystrophin.    Mỗi    probe    gồm    hai    chuỗi oligonucleotid, DNA (probe) lai ñặc hiệu với 79 exon của một chuỗi ngắn và một chuỗi dài. Mỗi chuỗi có 2 vị trí quan trọng: (1) vị trí liên kết ñặc hiệu và liền kề nhau trên trình tự exon ñích, tạo ñiều kiện cho enzym ligase gắn 2 chuỗi thành probe hoàn chỉnh. Nếu gen bị ñột biến, probe tương ứng với exon bị xóa không ñược hình thành do 2 sợi oligonucleotid không lại gần ñược với nhau; (2) vị trí gắn mồi khuếch ñại probe, có trình tự giống hệt nhau, nên chỉ cần một cặp mồi duy nhất ñể khuếch ñại tất cả probe. Riêng ở chuỗi dài có thêm một ñoạn ñệm gồm số nucleotid khác nhau, nhờ ñó các probe có sự khác biệt về kích thước, giúp phân tách khi ñiện di mao quản sau khuếch ñại probe. Kết quả ñiện di sẽ cho 79 ñỉnh có kích thước tương ứng với 79 probe ñặc hiệu với 79 exon, exon bị xoá ñoạn khi ñỉnh của exon ñó không phát hiện ñược.
+ Tiến hành: Cho 5µl DNA cần phân tích vào 1 ống PCR, biến tính ở 98oC/5 phút. Nhiệt ñộ ñược chuyển về 2oC trước khi cho 3µl hỗn hợp chứa các ñoạn oligonucleotid của các probe. Hỗn hợp ñược ủ ở 60oC/16 giờ, lúc này 2 ñoạn lai của 2 phân tử oligonucleotid sẽ gắn với exon ñích ñặc hiệu ở vị trí sát nhau. Thêm 32µl hỗn hợp ligase buffer, ủ ở 54oC/15 phút, enzym ligase nối 2 ñoạn oligonucleotid của probe với nhau. Phản ứng nối chấm dứt khi tăng nhiệt ñộ lên 98oC/5 phút, hỗn hợp ñược giữ ở 4oC. Khuếch đại sản phẩm lai: Thêm 10µl sản phẩm lai vào 30µl hỗn hợp PCR buffer, giữ ở 60oC trước khi thêm 10µl hỗn hợp PCR   master,  thực   hiện   chu   trình   nhiệt: [95oC/30 giây, 60oC/30 giây, 72oC/1 phút] x 35 chu kỳ, 72oC/20 phút; sản phẩm ñược bảo quản ở 4oC. Sản phẩm khuếch ñại probe ñược ñiện di mao quản huỳnh quang trên máy giải trình tự để phân tích kết quả. Nếu có ñột biến xóa  ñoạn,  probe không gắn  ñược  vào  gen đích, do ñó kết quả điện di sẽ không xuất hiện ñỉnh tương ứng tại exon ñột biến [1,2].