Ứng dụng kỹ thuật pcr đa mồi, điện di polyacrylamide, nhuộm bạc để phát hiện các locút str trong xác định huyết thống

Ứng dụng các kỹ thuật phân tích ADN là một trong những nhiệm vụ vô cùng quan trọng trong công tác giám ñịnh tư pháp phục vụ ñiều tra hình sự, xác ñịnh huyết thống phục vụ nhu cầu thực tiễn của xã hội. Từ năm 1985, khi lần ñầu tiên Peter Gill và Alex Jeffreys ứng dụng kỹ thuật ADN vào lĩnh vực này, cho ñến nay ñã có rất nhiều các nhà khoa học trên thế giới ñi sâu nghiên cứu và phát triển nhanh chóng. Trong giám ñịnh huyết thống, nhận dạng cá thể, người ta sử dụng các locút di truyền chứa các ñoạn ADN có trình tự lặp lại ngắn còn gọi là các locút STR (Short tandem repeat) ñể phân tích. Các ñoạn lặp lại ngắn này thường có chiều dài từ 2 ñến 6 nucleotit và ở mỗi cá thể có số lần lặp lại khác nhau, do vậy các locut này có tính ña hình cao nên rất có giá trị ñể phân biệt cá thể. Ví dụ, locút D7S280 thường sử dụng trong giám ñịnh huyết thống có trình tự lặp lại là “GATA”. Các allen khác nhau của locút này có từ 6 ñến 15 trình tự lặp lại “GATA”. Thông thường, các ñoạn gen sau khi ñược khuếch ñại bằng phương pháp PCR ña mồi sẽ ñược phát hiện bằng phương pháp ñiện di, nhuộm bạc hoặc gắn huỳnh quang [2].
Sự lựa chọn và ứng dụng các kỹ thuật phân tích ADN trong xác ñịnh huyết thống hết sức cần thiết, ñòi hỏi tính khoa học, chính xác, nhanh chóng. Ở Việt Nam, bên cạnh phương pháp gắn huỳnh quang ñiện di mao quản trên máy giải trình tự thì phương pháp ñiện di gel polyacrylamide, nhuộm bạc  ñể  phát  hiện  các  locút  STR  thường  ñược nhiều phòng xét nghiệm lựa chọn do chi phí thấp hơn nhiều, dễ dàng nhận biết bằng mắt thường và phù hợp với ñiều kiện trang thiết bị. Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu: Hoàn thiện kỹ thuật PCR ña mồi, ñiện di polyacrylamide và nhuộm bạc trong xác ñịnh huyết thống.
II.    ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1.    Đối tượng
130 cá thể, gồm 50 cặp nghi ngờ bố – con, 10 gia ñình có ñủ bố, mẹ, con ñược xét nghiệm ADN ñể xác ñịnh quan hệ huyết thống bố – con tại Khoa Y – Sinh học, Viện Pháp y Quốc gia trong thời gian từ năm 1/2009 ñến 3/2011. Trong ñó: 90 cá thể ñược lấy mẫu máu tươi hoặc lưu máu khô trên thẻ lấy mẫu chuyên dụng, 14 cá thể lấy mẫu móng tay, 16 cá thể lấy mẫu tóc và 10 cá thể ñược lấy tế bào niêm mạc miệng.
2.    Phương pháp
Chuẩn bị mẫu: Một trong các loại mẫu (máu tươi 5 – 10 µl, máu khô 0,2 cm2 giấy thấm, chân tóc 3
–    5 sợi, móng tay 0,2 – 0,5g ñược rửa sạch, 2 ñầu tăm bông phết tế bào niêm mạc miệng) cho  vào  ống eppendorf 1.5ml. Tách chiết ADN tổng  số: Theo phương pháp dùng chelex 10% [9].
–    Bổ  sung  1ml  ñệm  PBS  vào  trong   ống eppendorf, lắc ñều 3 – 5 giây, ñể 5 phút.
–    Ly tâm ở nhiệt ñộ phòng 12.000 vòng/phút, 5 phút. Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn.(Lặp lại bước 1 → 2 từ 1 ñến 2 lần ñể làm sạch mẫu).
–    Bổ sung 150 – 200 dung dịch chelex 10%, 10 – 15 ml dung dịch protein K (10mg/ml)
–    Lắc mạnh 3 – 5 giây. Ủ ở nhiệt ñộ 56oC trong vòng 60 phút. Đun sôi trong 8 phút.
–    Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Sau ñó hút dịch pha trên (100 – 200ml) sang ống eppendorf 1.5ml vô trùng và bảo quản ở – 20oC. Dịch nổi ñược sử dụng cho PCR.
–    Độ tinh sạch và nồng ñộ ADN ñược ño  OD 260/280 nm và ñiện di gel agarose 2%.
Phản ứng PCR: Sử dụng kít multiplex PCR gồm 9 locút STR theo các bộ ba (CFS1P0, TPOX, TH01), (D16S359, D7S820, D3S317), (F13A01, FESFPS, vWA) của hãng Promega (Mỹ); 6 locút STR   ñược   thiết   kế   theo  bộ   ba   (D3S1358, D8S1179, D18S51), (D5S818, D21S11, FGA) và Amelogenin của hãng Invitrogen.
Nghiên cứu nhằm hoàn thiện kỹ thuật PCR ña mồi, ñiện di polyacrylamide, nhuộm bạc trong xác ñịnh huyết thống. Đối tượng và phương pháp: 154 cá thể từ 50 cặp nghi ngờ bố – con, 18 gia ñình có bố, mẹ, con ñược phân tích ADN từ mẫu máu, móng tay, tóc, hoặc tế bào niêm mạc miệng ñể xác ñịnh quan hệ huyết thống tại Viện Pháp y Quốc gia. Kết quả nghiên cứu: ADN tách chiết từ các mẫu sinh phẩm khác nhau bằng phương pháp chelex ñều có nồng ñộ tương ñối cao. Mẫu máu cho nồng ñộ ADN cao nhất, tiếp ñến là mẫu tế bào niêm mạc miệng, mẫu móng tay và mẫu tóc. Phản ứng PCR ña mồi theo từng bộ ba locút STR, ñiện di gel polyacrylamide và nhuộm bạc cho các băng rõ ràng, sắc nét. Qua phân tích 15 locút STR ñã xác ñịnh ñược 55 cặp bố – con có quan hệ huyết thống với ñộ chính xác ñạt 99,97% ñến 99,999% và 13 cặp bố – con không có quan hệ huyết thống. Kết luận: Đã hoàn thiện ñược kỹ thuật, PCR ña mồi, điện di gel polyacrylamide và nhuộm bạc.