ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN VI SINH VẬT TRONG DƯỢC PHẨM
TÓM TẮT
Mở đầu: Dược phẩm cần phải đạt các tiêu chuẩn an toàn cao để không gây nguy hiểm cho người bệnh. Một trong các yếu tô’ nguy cơ là sự nhiễm các vi sinh vật. Thời gian xác định giới hạn vi sinh vật theo phương pháp truyền thông là từ 5 đến 7 ngày. Kỹ thuật RT-PCR cho phép xác định nhanh giới hạn nhiễm khuẩn trong dược phẩm.
Mục tiêu: Xây dựng phương pháp RT-PCR để xác định nhanh giới hạn vi sinh vật trong các mẫu dược phẩm.
Phương pháp: Dựa trên phương pháp PCR, tiến hành khảo sát các điều kiện tôi ưu, độ đặc hiệu và độ nhạy của các cặp cặp mồi chung và mồi đặc hiệu, khảo sát thời gian tăng sinh thích hợp để phát hiện từng loại vi sinh vật. Sau đó kiểm tra các thông sô’tôi ưu bằng phản ứng RT-PCR.
Kết quả: Xác định được nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg2+ cho các cặp mồi. Các cặp mồi đều đạt độ đặc hiệu để phát hiện vi khuẩn, vi nấm và vi sinh vật chỉ thị và có giới hạn phát hiện tôt. Phương pháp RT-PCR rút ngắn thời gian của kiểm tra giới hạn nhiễm vi sinh vật khoảng 5 lần so với phương pháp Dược điển.
Kết luận: Phương pháp RT-PCR thích hợp đểxác định nhanh giới hạn nhiễm khuẩn trong dược phẩm.
Dược phẩm là chế’ phẩm dùng để phòng và điều trị bệnh, do đó cần phải đạt các tiêu chuẩn an toàn cao để không gây nguy hiểm cho người bệnh. Một trong các yếu tố’ nguy cơ là sự nhiễm các vi sinh vật, các vi sinh vật này có thể gây bệnh trực tiếp hoặc gián tiếp làm hỏng dạng bào chế, làm cho chế’ phẩm không chỉ mất đặc điểm cảm quan mà còn mất tác dụng điều trị. Dược điển Việt Nam quy định các dạng thuốc dùng đường uống không chứa chất bảo quản phải đạt các giới hạn về độ nhiễm khuẩn, việc xác đinh giới hạn vi sinh vật được thực hiện theo phương pháp tăng sinh, và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc(1), tuy nhiên thời gian để có kết quả một mẫu kiểm nghiệm là từ 5 đến 7 ngày, nếu mẫu không đạt chúng ta phải lặp lại một lần nữa, chưa kể đến phân lập vi khuẩn gây bệnh. Phương pháp này ngoài tốn kém thời gian, kết quả còn phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật viên kiểm nghiệm, thuốc sẽ lưu lại kho lâu hơn, gây tốn kém, tăng chi phí sản xuất, tăng giá thành. Trong khi hầu hết tuổi thọ các thuốc dùng đường uống ngắn (12 đến 24 tháng).
Gần đây, các nước tiên tiến trên thế’ giới đã bắt đầu áp dụng các phương pháp xác định nhanh giới hạn vi sinh vật trong quá trình kiểm tra để xuất xưởng. Các phương pháp này có độ nhạy cao và được chứng minh là tương đương với các phương pháp truyền thống, với phương pháp này có thể giúp tự động hóa một phần và cho kết quả khách quan hơn.
Kỹ thuật RT-PCR cho phép xác đinh nhanh và chính xác, do đó có thể ứng dụng để xác định số’ lượng vi sinh vật trên cơ sở mỗi vi sinh vật mang số’ bản sao biết trước của khuôn mẫu. Hiện nay, kỹ thuật RT-PCR đã khá phổ biến ở nước ta và ngày càng được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán, xét nghiệm.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các chủng vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật sử dụng gồm các chủng chuẩn của ATCC và các chủng được phân lập và giữ tại Bộ môn Vi sinh – Ký sinh: Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 43300, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhi, Streptococcus feacalis ATCC 29213, Bacillus subtilis PY 79, Bacillus cereus, Shigella sp., Klebsiella sp., Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404 và Monascus purpureus.
Hy vọng sẽ giúp ích cho các bạn, cũng như mở ra con đường nghiên cứu, tiếp cận được luồng thông tin hữu ích và chính xác nhất