Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy

Hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy là nguyên nhân hàng thứ hai của chậm phát triển tâm thần (CPTTT) và là nguyên nhân hàng đầu trong CPTTT có tính gia đình. Hội chứng này được gặp với tần suất 1/4000 ở nam và 1/8000 ở nữ [1]. Gen chịu trách nhiệm gây nên hội chứng nhiễm sắc thể (NST) X dễ gãy là FMR1 (Fragile X mental retardation 1) được nhận dạng năm 1991, dài 38

Kb, gồm 17 exon, trong đó tại vùng 5 không dịch mã  của  exon 1 có  các  bộ  ba CGG lặp  lại.  Gen bình thường lặp lại từ 6 – 54 lần, gen tiền đột biến lặp lại khoảng 55 – 200 lần và gen đột biến hoàn toàn  lặp  lại  trên  200 lần  [1]. Ngoài  ra, gen đột biến hoàn toàn còn có tình trạng methyl hoá đảo CpG ở vùng khởi động nên không thể tạo ra pro- tein tương ứng là FMRP. Hầu hết nam giới mang gen đột biến hoàn toàn sẽ có hội chứng NST X dễ gãy với biểu hiện CPTTT kèm một số dấu hiệu đặc trưng về hành vi và thể chất. Người nữ mang gen đột biến hoàn toàn có thể biểu hiện hội chứng này (thường ở mức độ nhẹ hơn) hoặc không tùy thuộc sự bất hoạt ngẫu nhiên một trong hai NST X. Gen tiền đột biến hầu như không gây CPTTT, tuy nhiên nó có thể tăng số lần lặp lại CGG và trở thành đột biến hoàn toàn khi được truyền từ mẹ sang con. Vì vậy, việc chẩn đoán hội chứng NST X dễ gãy ở trẻ CPTTT và  phát  hiện  những  người  mang gen tiền đột biến là hết sức quan trọng trong tư vấn di truyền. Trước đây, hội chứng NST X dễ gãy được chẩn  đoán  bằng  cách  nuôi cấy  tế  bào  trong môi trường nghèo folat hoặc thừa thymidin để tìm vị trí dễ  gãy  trên  nhánh  dài  NST X, tuy nhiên  tỷ  lệ dương tính giả và âm tính giả khá cao nên đã không còn sử dụng nữa [5]. Ngày nay, việc chẩn đoán được thực hiện bằng các  kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và Southern blot. Cho đến nay, ở nước ta chưa có nghiên cứu nào về hội chứng NST X dễ gãy có sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử này. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm hai mục tiêu:

1. Xác định hội chứng NST X dễ gãy trong số các trẻ CPTTT bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

2. Xác  định tình trạng  đột  biến  gen  FMR1 trong các gia đình có con mắc hội chứng NST X dễ gãy.

II. ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên 214 trẻ CPTTT từ 6 đến dưới 16 tuổi thuộc 7 phường xã của thành phố Huế, gồm có 136 trẻ nam và 78 trẻ nữ, được chẩn đoán xác định theo tiêu chuẩn ICD – 10 của Tổ chức Y tế thế giới.

2. Phương pháp nghiên cứu

Chiết tách ADN từ tế bào máu ngoại vi

Lấy 2 ml máu tĩnh mạch ngoại vi, chống đông bằng   EDTA.  Chiết   tách   bằng   kit   AquaPure genomic DNA (Bio – Rad).

Sàng lọc bằng kỹ thuật PCR
Trình tự  cặp  mồi:  5 – GTC AGG CGC TCA GCT CCG TTT – 3 (mồi  xuôi)  và  5 – CTC CAT CTT CTC TTC AGC CCT GCT – 3 (mồi ngược). [2]

Thành phần phản ứng: GoTaq Green Master Mix (Promega), mồi, ADN và bổ sung betaine, dimethyl sulfoxide. Điều kiện luân nhiệt: 950C, 5 phút; 30 chu kỳ 950C, 1 phút; 560C, 1 phút; 720C, 2 phút; cuối cùng thêm 720C, 8 phút.

Sản   phẩm   PCR  sau  khi  điện   di,  nhuộm ethidium bromide được  phân  tích bằng  hệ thống GelDoc (Bio – Rad), với công cụ chuyên biệt giúp xác định kích thước sản phẩm PCR, sau đó tính số lần lặp lại theo công thức:

Số  lần  CGG lặp  lại  = (kích thước  sản  phẩm PCR – 203): 3 trong đó 203 bp là tổng kích thước của  2 đoạn  ADN ở  2 đầu  sản  phẩm  PCR không bao gồm đoạn CGG lặp lại.Chỉ định làm Southern blot cho những  trường hợp có kết quả sau:

Không có sản phẩm PCR: nghi ngờ có tiền đột biến  với  số  lần  lặp  lại  của  CGG lớn  (100 – 200 lần) hoặc đột biến hoàn toàn.

Chỉ có 1 sản phẩm PCR ở nữ: không phân biệt được là mang 2 alen cùng số lần CGG lặp lại hay mang 1 alen có số lần lặp lại bé và 1 alen có số lần lặp lại lớn

Chẩn   đoán   xác   định  bằng   kỹ   thuật Southern blo

Nam: Bình thường có 1 băng 2,8 Kb. Tiền đột biến  có  1 băng  kích thước  từ  2,8 – 3,4 Kb. Đột biến hoàn toàn có 1 hoặc nhiều băng kích thước trên 5,8 Kb.

Nữ: Bình thường có 2 băng 2,8 Kb và 5,2 Kb. Tiền đột biến có các băng 2,8 Kb và 5,2 Kb tương ứng alen bình thường, các băng từ 2,8 – 3,4 Kb và từ 5,2 – 5,8 Kb tương ứng alen tiền đột biến. Đột biến  hoàn  toàn  có  các  băng  2,8 Kb; 5,2 Kb và băng trên 5,8 Kb. [6]
Thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gen của  viện  Tài  nguyên,  Môi  trường  và  Công  nghệ sinh học, Trường Đại học Huế, thời gian từ tháng 1/ 7/2007.