Ứng dụng một số quy trình tách chiết adn và kỹ thuật elisa, pcr đánh giả vai trò truyền bệnh của muỗi aiv.minimưs và an.dirus ở Khánh Phú,Khánh Vĩnh, Khánh Hoà

Đề tài đã lựa chọn được hai phương pháp tách chiết ADN của ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) từ muỗi sốt rét đổng thời ứng dụng thành công các kỹ thuật ELISA, PCR để nghiên cứu mức độ nhiễm KSTSR và đánh giá vai trò truyền bệnh của muỗi An.minimus, An.dirus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà.
1.2.    Kết quả cụ thể của đề tài
Hai phương pháp tách chiết ADN bằng Chelex-100 và bằng phenol kết tủa cồn đều có thể sử dụng để tách chiết ADN của KST sốt rét từ các mẫu vật làm ELISA, muỗi khô để lâu ngày và mẫu vật thoa trùng mổ từ muỗi Anopheles. Sản phẩm ADN đảm bảo chất lượng cho việc thực hiện kỹ thuật PCR.
Thử nghiệm ELISA phát hiện tỷ lệ nhiêm KSTSR cao của muỗi An.dims (7,16 giai đoạn 1993-1998; 4,25% giai đoạn 1999-2005) và muỗi An.minimus (7,25% trước 1998) tại Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà. Thử nghiệm PCR khẳng định tất cả các kết quả thử ELISA, xác định thoa trùng ở hai loài muỗi An.minimus và An.dirus là KSTSR gây bệnh ở người và p.falciparum chiếm tỷ lệ cao.
Cả hai loài muỗi An.minimus và An.dints đểu là những muỗi truyền bệnh sốt rét chủ yếu ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà. Sau năm 1998, mật độ muỗi An.minimus giảm đi rõ rệt và An.dirus vẫn còn là vectơ sốt rét quan trọng duy trì và lan truyền sốt rét ở điểm nghiên cứu.
1.3.    Hiệu quả đào tạo.
–    Nâng cao trình độ thực hành các kỹ thuật, đặc biệt là kỹ thuật sinh học phân tử cho cán bộ nghiên cứu.
–    Cung cấp số liệu cho hai khoá luận tốt nghiệp cử nhân sinh học.
1.4.    Hiệu quả vê kinh tế.
ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử có thể nghiên cứu hồi cứu nhiều số liệu dịch tễ học bệnh sốt rét mà các nghiên cứu khác không thể làm được. Vì thế rất có hiệu quả về mặt kinh tế.
1.5.    Hiệu quả xã hội.
Việc đánh giá đúng vai trò truyền bệnh hiện nay của muỗi An.minimus và An.dirus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà giúp ta có định hướng đúng, tập trung nghiên cứu và tuyên truyền, giáo dục nhân dân thực hiện các biện pháp phòng chống muỗi truyền sốt rét rừng: An.dirus, đổng thời cũng quan tâm đến sự phục hồi quần thể An.minimus.
1.6.    Các hiệu quả khác
Mở ra triển vọng trao đổi hợp tác nghiên cứu khoa học và ứng đụng thực tiễn lĩnh vực sinh học phân tử bệnh sốt rét ở trong nước cũng như quốc tế.
2.    ÁP DỤNG VÀO THỰC TIEN SảN XUấT VÀ ĐờI SốNG XÃ HộI.
Kết quả nghiên cứu đã khẳng định vai trò truyền bệnh sốt rét hiện nay của An.dirus và đang triển khai những nghiên cứu sâu hơn về sinh học cũng như biện pháp phòng chống loài muỗi này, đồng thời cũng cần quan tâm theo dõi sự phục hồi của quần thể An.minimus.
3.    ĐÁNH GIÁ THỰC HIỆN ĐỂ TÀI Đối CHIÊU VỚI ĐỂ CƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT
a.    Đề tài đã thực hiện đúng tiến độ (từ 6/2002 đến tháng 12/2005)
b.    Đã thực hiện đầy đủ 2 mục tiêu nghiên cứu là:
•    Hoàn thiện quy trình tách chiết ADN của KSTSR trên tiêu bản thoa trùng, trong tiêu bản muỗi khô để lâu ngày, và dịch nghiền dùng để thử ELISA.
•    Sử dụng kỹ thuật ELISA và PCR để đánh giá vai trò truyền bệnh của An.minimus và An.dirus ở thí điểm Khánh Phú.
c.    Đề tài đã thực hiện đầy đủ các nội đung nghiên cún (bốn nội dung) và đã tạo ra các sản phẩm đúng như dự kiến của bản đề cương, cụ thể là:
•    Đã lựa chọn và hoàn thiện được quy trình    tách    chiết    ADN của
KSTSR tại tiêu bản thoa trùng, muỗi khô    để lâu    ngày    và    dịch
nghiền thử nghiệm ELISA.
•    Đã kiểm tra kết quả ELISA bằng kỹ thuật PCR và đánh giá khả năng áp dụng của phương pháp PCR.
•    Đã ứng dụng kỹ thuật ELISA và PCR để đánh giá mức độ nhiễm KSTSR và vai trò truyền bệnh của muỗi An.minimus và An.dirus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà.
•    Đã có các báo cáo tiến độ và báo cáo tổng kết đúng kỳ hạn.
d.    Đánh giá về việc sử dụng kinh phí
Đề tài đã sử dụng kinh phí đúng mục đích và đúng nguyên tắc tài chính.
Tổng số kinh phí được duyệt: 189.960.000 đồng
Tổng số kinh phí đã sử dụng: 189.960.000 đổng
4.    CÁC Ý KIẾN ĐỂ XUẤT
Đề nghị có đề tài cấp bộ ứng dụng các kỹ thuật cao    vào nghiên cứu dịch tễ
học phân tử bệnh sốt rét tại Khánh Phú,    Khánh    Vĩnh,    Khánh Hoà    cũng    như
một số trọng điểm sốt rét khác
PHẦN B. NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIÊT KẾT QUẢ NGHIỆN cứu
1.    ĐẶT VẤN ĐỂ
Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, khí hậu nóng ẩm quanh năm, tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều loài muỗi sống và phát triển trong đó có muỗi Anopheles. Nhiều loài trong giống muỗi này được xác định là vectơ truyền bệnh sốt rét chủ yếu và thứ yếu ở nước ta. Hiện nay việc nghiên cứu tìm ra phương pháp phát hiện nhanh, chính xác các loại ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) ở người để có biện pháp điều trị và ở muỗi để đánh giá đúng các vectơ, tìm cách phòng chống thích hợp là yêu cầu cần thiết.
Trên thế giới, các nhà’»khoa học đã nghiên cứu tìm ra nhiều kỹ thuật để xác định KSTSR người, ở muỗi như kỹ thuật mổ tự nhiên, kỹ thuật miễn dịch hấp phụ liên kết enzym (ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) và kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR: polymerase chain reaction).
ở Việt Nam, kỹ thuật mổ muỗi tự nhiên để phát hiện KSTSR trên kính hiển vi quang học đã được áp dụng từ khá sớm, đến nay kỹ thuật vẫn có giá trị thực tiễn và đáng tin cậy. Tuy nhiên, kỹ thuật này có một số hạn chế như không phát hiện được chính xác loài KSTSR, những trường hợp có mật độ KST nhiễm thấp, nhiễm phối hợp hai hay nhiều loại KST. Trong những năm gần đây, một số kỹ thuật tiên tiến đã và đang được ứng dụng vào nghiên cứu xác định KSTSR trong muỗi như kỹ thuật ELISA, kỹ thuật PCR, với những ưu điểm như độ nhạy cao, khả năng phát hiện được nhiều loại KST, phát hiện được những trường hợp nhiễm phối hợp. Các kỹ thuật trên đã khắc phục được những nhược điểm của kỹ thuật mổ tự nhiên.
Xã Khánh Phú, huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hoà nằm trong vùng sốt rét lưu hành nặng của nước ta. Từ năm 1993 đến nay, Ưỷ ban IIợp tác Y tế Việt Nam- Hà Lan (MCNV) đã kết hợp với Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Qui Nhơn và Trung tâm Phòng chống sốt rét và các rối loạn thiếu I ốt tỉnh Khánh Hoà tiến hành nghiên cún sốt rét và vectơ sốt rét tại đây.
Trong quá trình nghiên cứu tại thí điểm Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà, đã thu thập và hiện còn đang lưu giữ hàng trăm tiêu bản thoa nghiền muỗi dương tính với protêin bề mặt thoa trùng (CSP) trong thử nghiệm ELISA và hàng nghìn tiêu bản muỗi khô chưa xác định mức độ nhiễm KSTSR qua các thời kỳ sử dụng các biện pháp phòng chống sốt rét (PCSR) khác nhau. Chính vì vậy, đề tài nghiên cứu: “Ưng dụng ữiột số quy trình tách chiết ADN và kỹ thuật ELISA, PCiR đánh giá vai trò truyền bệnh của muỗi An.minimus và An.dirus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà” được thực hiện với hai mục tiêu nghiên cứu là:
1.    Lựa chọn và hoàn thiện qui trình tách chiết ADN của ký sinh trùng sốt rét trên tiêu bản thoa trùng, trong muỗi khô để lâu ngày và dịch chiết sau khi đã thử ELISA.
2.    Sử dụng kỹ thuật ELISA, PCR để xác định vai trò truyền bệnh sốt rét của muỗi An.minimus và An.dirus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà.
MỤC LỤC
Phần A. TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ Nổi BẬT CỦA ĐỂ TÀI
1.    KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
2.    ÁP    DỤNG VÀO THựC TIÊN SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SốNG XÃ HỘI.
3.    ĐÁNH GIÁ THựC HIỆN ĐỀ TÀI ĐÔÌ CHIÊU VỚI ĐỀ CƯƠNG
NGHIÊN cúư ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT    3
4.    CÁC Ý KIẾN ĐỀ XUẤT    3
PHẦN B. NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUả NGHIÊN CứU    4
1.    ĐẶT VẤN ĐỂ    4
2.    TỔNG QUAN TÀI LIỆU LIÊN QUAN ĐÊN ĐỀ TÀI    6
2.1.    Các phương pháp xác    định ký sinh trùng sốt rét trong muỗi    6
2.1.1.    Kỹ thuật mổ tự nhiên.    6
2.1.2.    Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ liên kết enzym (ELISA).    6
2.1.3.    Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase ịPCR).    1
2.2. lình hình nghiên cứu ở trong nước và ở nước ngoài.    8
2.2.1.    Tình hình nghiên cứu ở trong nước.    8
2.2.2.    Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài.    10
3.    THỜI GIAN, ĐỊA ĐlỂM, Đối TƯợNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN cúu    12
3.1.    Thời gian nghiên cứu    12
3.2.    Địa điểm nghiên cứu    12
3.3.    Đối tượng nghiên cứu    12
3.4.    Phương pháp nghiên cứu    12
3.4.1.    Mổ muỗi trực tiếp, soi bằng kính hiển vi quang học    12
3.4.2.    Kỹ thuật ELISA    13
3.4.3.    Kỹ thuật phản ứng chuối polymerase (PCR)    15
3.4.4.    Ú lý số liệu    19
4.    KẾT QUẢ NGHIÊN cúu    20
4.1.    Hoàn thiện kỹ thuật tách chiết ADN của KST ở tiêu bản thoa trùng,
trong mẫu khô để lâu ngày và ở dịch nghiền làm ELISA    20
4.1.1.    Quy trình tách chiết AND từ tiêu bản thoa trùng khô bằng Cheìex-100 
4.1.2.    Quy trình tách chiết AND từ tiêu bản thoa trùng khô bằng Phenol
4.1.3.    Quy trình tách chiết AND từ tiêu bản thoa trùng tươi bằng Chelex-100
4.1.4.    Quy trình tách chiết AND từ tiêu bản thoa trùng tươi bằng Phenoỉ
4.1.5.    Quy trình tách chiết AND từ mẫu vật đã làm ELỈSA bằng Chelex-100
4.1.6.    Quy trình tách chiết AND từ mẫu vật đã làm ELISA bằng Phenol
4.1.7.    Quy trình tách chiết ANDcủa KSTtừ tiểu bản muỗi khô bằng Chelex-100
4.1.8.    Quy trình tách chiết AND của KSTtừ tiêu bản muối khô bằng Phenoỉ
4.2.    Thử nghiệm ELISA xáo,định mức độ nhiễm KST sốt rét của muỗi An.dirus và An.minimus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà
4.3.    Thử    nghiệm PCR đánh giá mức độ nhiễm KST sốt rét ở muỗi An.dirus và An.minimus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà.
4.4.    Điều tra bổ sung, mổ muỗi, kiểm tra bằng ELISA, PCR xác định mức độ nhiễm KSTSR của muỗi An.dirus và An.mỉnimus
giai đoạn 2002- 2005.
4.5.    Đánh giá vai trò truyền bênh của An.minimus và An.dirus tại Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà qua kết quả ELISA và PCR
5.    BÀN LUẬN
5.1.    Hoàn thiện một số quy trình tách chiết ADN của KSTSR ở các mẫu đã thử nghiệm ELISA, mẫu muỗi khô, mẫu thoa trùng
5.2.    ứng dụng kỹ thuật ELISA, PCR đánh giá mức độ nhiễm KSTSR và xác định vai trò truyền bệnh của muỗi An.minimus, An.dirus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà.
5.3.    Đánh giá vai trò truyền bệnh của An.minimus và An.dirus ở Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà
6.    KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
6.1.    Kết luận
6.2.    Đề nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO