Ứng dụng pcr và giải trình tự trong chẩn đoán định danh nguyên nhân viêm mủ nội nhãn nội sinh do vi khuẩn

Mục tiêu: Nhằm bước đầu đánh giá hiệu quả của kỹ thuật PCR và giải trình tự trong chẩn đoán định danh vi khuẩn gây bệnh ở những mẫu bệnh phẩm lấy ở những bệnh nhân nghi ngờ VMNNNSVK.
Phương pháp: Nghiên cứu mô tả không có đối chứng. Dùng kỹ thuật PCR và giải trình tự để phân tích 23 bệnh phẩm dịch kính ở 23 bệnh nhân (nằm điều trị tại Bệnh Viện Mắt Trung Ưong từ 4/2008 đến 11/2008) có triệu chứng lâm sàng điển hình của VMNNNSVK có so sánh với kết quả của nhuộm soi và nuôi cấy. Các thử nghiệm được tiến hành tại khoa Vi sinh, trường Đại học Gifu, Nhật Bản, tháng 1/2009.
Kết quả: Kết quả nhuộm soi: 8/23 (34.8%) trường hợp cho kết quả âm tính trong khi đó PCR dương tính ở tất cả các trường hợp. Trên 10/23 (43.5%) nhuộm soi quan sát thấy nhiều loại vi khuẩn, nhưng chỉ có 3 trường hợp trong số này được khẳng định trên PCR, 7 trường hợp còn lại giải trình tự chỉ cho kết quả của 1 loại vi khuẩn. Kết quả nuôi cấy: nuôi cấy cho tỷ lệ dưong tính thấp (3/23 – 13% ). 3 trường hợp dương tính này đều trùng khớp với kết quả của PCR và giải trình tự sau này. PCR và giải trình tự cho thấy gần (11/23) các trường hợp là phế cầu (Streptococcus pneumoniae). Có 5 trường hợp phát hiện nhiều loại vi khuẩn nhưng do khó khăn về kỹ thuật chúng tôi không làm được tách dòng để xác định từng loại vi khuẩn. Các trường hợp còn lại gồm: Enterococcus casseliflanis (1), Streptococcus sp (1), Staphylocuccus sp (1), S. heamolyticus (1), Bacillus sp (1), S. sciuri (1), Enterobacter hormaecher (1).
Kết luận: PCR và giải trình tự cho kết quả định danh vi khuẩn chính xác hơn nhuộm soi và nuôi cấy, giúp ích cho điều trị đồng thời góp phần xác định ổ nhiễm trùng nguyên phát của bệnh VMNNNSVK.
Đặt vấn đề
Viêm mủ nội nhãn nội sinh do vi khuẩn (VMNNVK) là một bệnh lý viêm nhiễm nặng nề ở các mô và dịch nội nhãn, do sự xâm nhập của vi khuẩn từ cơ quan khác qua đường máu đến mắt.
Đây là một bệnh lý cấp cứu có thể gây tổn hại lớn về chức năng thị giác thậm chí có thể phải bỏ nhãn cầu.
Vi khuẩn khi đến mắt (cơ quan đích) cần có điều kiện thuận lợi để phát triển. Điều kiện thuận lợi đó là sự suy giảm sức đề kháng của cơ thể. VMNNNS theo y văn thường gặp ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch hoặc suy kiệt do các bệnh lý toàn thân. Tuy nhiên trên thực tế lâm sàng ở Việt Nam, chúng tôi thường gặp VMNNNS trên những bệnh nhân trẻ, khoẻ mạnh. Cho đến nay vẫn chưa có lời giải thích thoả đáng cho hiện tượng lâm sàng này. Hàng năm có hàng trăm bệnh nhân VMNNNSVK nhập viện tại Bệnh viện mắt Trung Ương trong tình trạng bệnh rất nặng nề, rất nhiều bệnh nhân đã phải bỏ mắt do mù và đau nhức mặc dù đã được điều trị tích cực. Một trong những khó khăn gặp phải trong quá trình chăm sóc là chẩn đoán nguyên nhân của bệnh. Việc xác định tác nhân gây bệnh có tầm quan trọng to lớn, quyết định hiệu quả của quá trình điều trị và tiên lượng chức năng của bệnh. Cho đến nay, các xét nghiệm vi sinh kinh điển thường làm là nhuộm soi và nuôi cấy vi khuẩn. Tuy nhiên nuôi cấy vi khuẩn có tỷ lệ dương tính thấp thay đổi từ 21 – 63% (tuỳ theo các nghiên cứu khác nhau công bố trên y văn). Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là: bệnh phẩm nội nhãn (thuỷ dịch hoặc dịch kính) lấy được quá ít hoặc quá loãng,    sử    dụng    kháng sinh    trước    khi nuôi    cấy,    và có    thể    do    bản    chất    phát    triển    chậm    của    tác nhân. Ở Việt Nam tỷ lệ dương tính của nuôi cấy là 22.2% (Hoàng Thị Hiền 2005) [4] thấp hơn so với y văn. Điều này có thể được giải thích như sau: (1) bệnh nhân thường nhập viện khá muộn sau khi đã được điều trị rất nhiều bằng kháng sinh trước đó (toàn thân và tại chỗ); (2) môi trường nuôi cấy chưa đạt chuẩn, hiện chưa có môi trường nuôi cấy yếm khí. Thực tế lâm sàng này cho thấy nhu cầu thiết yếu của việc sử dụng một loại xét nghiệm khác có độ nhậy và độ đặc hiệu cao hơn, trả lời kết quả nhanh hơn, giúp cho xác định chẩn đoán từ đó có hướng điều trị sớm và đặc hiệu.
Từ 10 năm trở lại đây, nhiều tác giả trên thế giới đã thông báo về sử dụng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) và giải trình tự (sequencing) trong phân tích dịch nội nhãn lấy từ bệnh nhân nghi ngờ VMNN. Kỹ thuật này có thể khắc phục được các nhược điểm của kỹ thuật phân lập và nuôi cấy kinh điển: (1) chỉ cần lượng bệnh phẩm ít; không đòi hỏi bệnh phẩm phải chứa sinh vật còn sống (nghĩa là phân tích được cả những bệnh phẩm của những bệnh nhân đã được điều trị kháng sinh trước đó); trả kết quả khá nhanh (trong vòng khoảng 24 giờ sau khi lấy bệnh phẩm).