Ứng dụng phương pháp pcr bán định lượng và định lượng xác định mức độ sao chép của Heparansulphat Interacting Protein (hip) ở mô ung thư

Heparin và heparansulfate (HP/HS) là đại phân tử  mang điện  âm  với độ  sulphate hóa rất cao, chính vì vậy chúng có khả năng tương tác với nhiều loại protein trong các quá trình sinh học khác nhau và  đóng vai trò rất quan trọng trong việc hình thành và duy trì cấu trúc chức năng của tế bào [1]. Daniel D. Carson và cộng sự đã phát hiện ra một protein bề  mặt tế bào biểu mô thận người và một số dòng tế bào khác, protein này được đặt tên là Heparansulphat Interacting Protein (HIP) [2]. Đây là một protein có chiều dài 155 aa với trọng lượng phân tử  khoảng 18 kDa [3]. Khi nghiên cứu sâu hơn về chức năng sinh học của HIP các tác giả đã phát hiện ra rằng HIP cũng có chức năng tương tự như những protein gắn ái lực với HP/HS và chúng được tổng hợp nhiều  ở các dòng tế bào nội mạc và tế bào biểu mô trưởng thành. Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng HIP được tăng cường tổng hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư ở cả mức độ RNA thông tin và protein như: ung thư tuyến giáp trạng và ung thư vú, ung thư đại tràng… Đặc biệt mức độ biểu hiện của HIP liên quan chặt chẽ với quá trình phát triển và xâm lấn của ung thư và  phụ thuộc vào mức độ ác tính của các dòng ung thư [4, 5]. Việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế ung thư ở mức độ phân tử, từ đó tìm ra phương pháp chẩn đoán hữu hiệu và điều trị sớm là một lĩnh vực đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm. Trong một vài nghiên cứu gần đây, bằng phương pháp RT – PCR chúng tôi đã phát hiện thấy mRNA của HIP được sao chép với một lượng đáng kể trong mô ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt trong khi đó không phát hiện được hoặc phát hiện rất thấp ở mô u xơ [6, 7]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp RT – PCR bán định lượng và định lượng để xác định mức độ sao chép của HIP ở mô ung thư, từ đó so sánh kết quả, đánh giá độ tin cậy của 2 phương pháp trên để ứng dụng chúng xác định mức độ sao chép của HIP và các gen khác trong chẩn đoán bệnh ung thư.

I.    ĐỐI    TƯỢNG    VÀ    PHƯƠNG    PHÁP
NGHIÊN CỨU

1.    Đối tượng
30 bệnh nhân ung thư được chẩn đoán xác định dựa trên lâm sàng, cận lâm sàng (siêu âm, hoá sinh, mô bệnh học) tại bệnh viện K Hà Nội. Chúng tôi sử  dụng 15 mẫu mô lành tính để làm đối chứng.
2.    Phương pháp nghiên cứu
    Tách chiết mRNA và tổng hợp  cDNA RNA tổng số được tách chiết từ mô ung thư theo quy trình chuẩn đã được mô tả trước đây [6]. 5 μg RNA tổng số được sử  dụng để tổng  hợp chuỗi cDNA bổ xung bằng phản ứng reverse transcript – polymerase chain reaction RT – PCR.
    Phương pháp PCR bán định lượng
Cặp mồi đặc hiệu với HIP có trình tự như sau: HIP – F: 5 – GCT TAT GGT GCA GAC ATG G – 3; HIP – R: 5 – CAG AGA TAT CTA CTC TGA AGC – 3. PCR được  tiến hành với  tổng thể  tích 20μl gồm: 4 μl cDNA, 2 μl 10x Ex Taq Buffer, 2 μl 2.5mM dNTPs, 10 pmol mồi xuôi và ngược, 1 unit Ex Taq Polymerase (Takara Bio Inc.Kyoto, Japan). Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: Biến tính 940C – 5 phút, 35 chu kỳ [940C – 50 giây, 580C – 50 giây, 720C – 50 giây], 720C – 5 phút. Sử dụng gen nội chuẩn GAPDH để đánh giá chất lượng RNA và so sánh lượng mẫu sử dụng trong phản ứng RT – PCR. Đậm độ mỗi vạch HIP và GAPDH được xác định nhờ phần mềm chuyên dụng. Mức độ sao chép của HIP được tính bằng tỉ lệ HIP/GAPDH rồi vẽ đồ thị.
    Phương pháp PCR định lượng  (Agilent 2100  Bioanalyzer with  DNA  1000  Lab  Chips; Agilent Technologies, Palo Alto, CA)
Phương pháp PCR định lượng được ứng dụng để đánh giá độ tin cậy của phương pháp trên. Quy trình PCR được tiến hành tương tự như phương pháp PCR bán định lượng. Vì phương pháp này rất nhạy và có  thể đánh giá được mức độ  sao chép của HIP cho dù ở mức độ rất thấp nên chu kỳ của phản ứng được giảm từ 35 xuống 24 chu kỳ. Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên hệ thống cap- illary (Capillary electrophoresis) và mức độ sao chép của HIP được xác định thông qua hệ thống máy tính. Kết quả PCR định lượng được biểu thị trên đồ thị tương ứng với các đỉnh. GAPDH cũng được sử dụng để so sánh lượng mẫu sử dụng trong mỗi phản ứng.
Phương pháp PCR bán định lượng và định lượng là những phương pháp đơn giản, chính xác và cho độ tin cậy tương đối cao được sử dụng rất rộng rãi để xác định mức độ biểu hiện của mỗi gen được khuyếch đại sau mỗi phản ứng PCR. Mục tiêu: Sử dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng để đánh giá mức độ sao chép của Heparansulphat Interacting Protein (HIP) ở mô ung thư so với mô lành tính; so sánh kết quả của 2 phương pháp trên. Phương pháp: Tách triết mRNA tổng số từ mô ung thư và lành tính; tổng hợp cDNA; xác định mức độ sao chép của HIP sử dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng. Kết quả: Cả phương pháp này đều cho kết quả tương tự như nhau; HIP được tăng cường sao chép rất rõ ở những mô ung thư trong khi đó phát hiện được rất thấp trên mẫu lành tính. Kết luận: Mức độ biểu hiện của HIP ở mô ung thư và mô lành tính khác biệt nhau một cách rõ rệt. Chúng ta có thể dùng một trong hai phương pháp PCR bán định lượng và định lượng trên để đánh giá mức độ sao chép của HIP trong chẩn đoán bệnh ung thư.