Ứng dụng phương pháp PCR – RFLP với vị trí cắt của Enzym bcli chẩn đoán người mang gen bệnh trong gia đình bệnh nhân Hemophilia a tại Việt Nam

Hemophilia A là bệnh ưa chảy máu di truyền do tổn thương gen tổng hợp yếu tố VIII. Gen tổng hợp yếu tố VIII nằm trên nhiễm sắc thể (NST) X, di truyền lặn do đó bệnh chủ yếu gặp ở nam.

Người  phụ  nữ  không  mang  bệnh  nhưng  là người mang gen và có thể truyền bệnh cho con trai, vì vậy xác định người mang gen trong gia đình bệnh nhân Hemophilia A hết sức có ý nghĩa trong phòng bệnh.

Hiện nay khoa học đã phát hiện có rất nhiều loại tổn thương gen VIII cho nên xác định trực tiếp gen tổn thương là rất khó. Tuy nhiên người ta biết có nhiều đột biến ADN trên gen yếu tố VIII không gây bệnh. Những đột biến này được coi là các chỉ điểm để phát hiện cá nhân mang gen bệnh. Trên thế giới đây là phương pháp được áp dụng nhiều. Đột biến được sử dụng phải khá thường gặp tạo nên tình trạng đa dạng ở một đoạn ADN và có tỷ

lệ dị hợp tử cao ở phụ nữ [2, 10]. Nhiều trung tâm Hemophilia đang sử dụng đa dạng ADN tại vị trí của điểm cắt bởi enzym hạn chế BclI ở intron 18 của gen VIII. Ở Việt Nam, cho đến nay chưa có nghiên cứu về gen yếu tố VIII, chưa có biện pháp phát hiện người phụ nữ mang gen trong gia đình bệnh nhân hemophilia A. Vì vậy, để xem xét ứng dụng tính đa dạng ADN tại intron 18 của gen yếu tố VIII trong việc xác định người phụ nữ mang gen, chúng tôi tiến hành ứng dụng kỹ thuật PCR và RFLPs (Restriction Fragment Length Polymor- phism) với enzym BclI nhằm mục tiêu:

– Khảo sát tỷ lệ đa dạng ADN ở điểm cắt BclI trên intron 18 ở một số đối tượng người  Kinh Việt Nam.

– Xác định tỷ lệ nữ dị hợp tử ADN ở điểm cắt enzym BclI gen yếu tố VIII.

– Ứng dụng trong chẩn đoán người mang gen bệnh trong gia đình bệnh nhân hemophilia A.

I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Khảo sát tần số đa hình có điểm cắt  với enzym BclI ở người Việt Nam

– 22 bệnh nhân hemophilia A được chẩn đoán và quản lý tại viện Huyết học – Truyền máu TW

– 40 phụ nữ là mẹ bệnh nhân hemophilia A.

– 31 phụ nữ khỏe mạnh.

Tất cả các đối tượng trên đều không có quan hệ huyết thống và được phân tích liên kết đa hình độ  dài  đoạn  cắt  enzym  giới  hạn  (polymerase chain reaction – restriction fragment length poly- morphism – PCR – RFLPs) với vị trí cắt đặc hiệu của  BclI trên intron 18 của gen yếu tố VIII, cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 (18F và 18R) được thiết kế theo Kogan và cộng sự (1987):

– 18F: 5 – TAAAAGCTTTAAATGGTCTAGGC – 3/

– 18R: 5 – TTCGAATTCTGAAATTATCTTGTTC – 3 Xét nghiệm được thực hiện tại phòng Sinh hoá

– khoa Di truyền – Sinh học phân tử viện Vệ sinh

Dịch tễ trung ương và khoa Miễn dịch – Di truyền viện Huyết học – Truyền máu Trung Ương.

Nguyên lý của phương pháp:

Đoạn ADN dài 142 bp trên intron 18 của gen yếu tố VIII có vị trí nhận biết đặc hiệu với enzym giới hạn BclI tại nucleotid số 99 với trình tự T¯GATCA. Bình thường, khi được ủ với enzym giới hạn   BclI,   BclI sẽ cắt đoạn ADN dài 142 bp thành hai đoạn nhỏ dài 99 bp và 43 bp – kết quả được coi là dương tính (+). Nếu có đột biến sẽ làm mất vị trí nhận biết của  BclI do đó khi ủ ADN với BclI thì ADN sẽ không bị cắt và điện di sản phẩm sẽ cho thấy băng ADN 142 bp vẫn giữ nguyên – kết quả được ghi nhận là âm tính (-).

Vì gen yếu tố VIII nằm trên nhiễm sắc thể X nên ở nam giới chỉ có 1 alen duy nhất do vậy kết

quả PCR – RFLPs với  BclI ở nam giới sẽ có 1 trong 2 trường hợp xảy ra là: [âm tính (-)] hoặc [dương tính (+)]. Còn ở nữ giới vì có 2 alen nên sẽ có 3 trường hợp xảy ra:

+ Băng ADN của cả 2 alen đều bị cắt [đồng hợp tử dương (+/+)],

+ Hoặc băng ADN của cả 2 alen đều không bị cắt [đồng hợp tử âm (- / -)],

+ Hoặc chỉ có băng ADN của 1 alen bị cắt còn của alen kia thì không bị cắt [dị hợp tử (+/ – )].

Tỷ lệ dị hợp tử lí thuyết của alen được tính theo công thức Hardy – Weiberg [1].

2. Áp dụng PCR – RFLPs với   BclI xác  định người mang gen bệnh trong gia đình bệnh nhân hemophilia A

– 9 gia đình bệnh nhân gồm: mẹ là  người mang gen hemophilia A, dị hợp tử với   BclI, bố bệnh nhân, bệnh nhân và chị/em gái  của bệnh nhân (người cần xác định tình  trạng  mang gen) được lấy máu phân tích PCR – RFLP với BclI.

Mẹ mang gen được xác định theo phả hệ: thỏa mãn 1 trong 3 điều kiện: (1) có ít nhất hai con trai bị bệnh; (2) là con của bệnh nhân hemophilia; (3) có 1 con trai bị bệnh và ít nhất 1 người đàn ông trong họ mẹ bị bệnh.

– Riêng 7 trong số 9 chị/em gái trên được định lượng yếu tố VIII bằng phương pháp 1 thì tại khoa Đông cầm máu viện Huyết học –  Truyền máu Trung Ương.