xác định 3 phân typ p – ala, p – thr và v – val của ebna – 1 ở virus epstein – barr phân lập tại Việt Nam
Epstein – Barr virus (EBV) gây sơ nhiễm ở phần lớn cộng đồng trên thế giới ngay từ tuổi nhỏ , nhưng chỉ một số phát triển thành ung thư vòm mũi họng (NPC, nasopharyngeal carcinoma), Burkitt lymphoma, bệnh Hodgkin T – lymphoma (Gruhne et al., 2009). Protein EBNA – 1 (Epstein – Barr Nuclear Antigen 1) là loại có mặt trong tất cả mọi dạng tiến triển khối u của EBV, xúc tiến quá trình tàng nhiễm ảnh hưởng đến sự nhân lên của hệ gen, sao chép và phân chia tế bào (Aiyar et al., 1998). Chuỗi polypeptide của EBNA – 1 chứa 641 acid amin (aa), chia làm 2 vùng chức năng chính, vùng N và vùng C, nối với nhau bằng chuỗi acid amin chèn, gồm nhiều motif lặp glycine/alanine (GAR) từ aa 90 đến aa 327 (Mai et al., 2007). Các acid amin vị trí từ 459 – 607 đầu tận cùng C có vai trò trung gian cho DNA bám dính và hình thành phân tử kép (dimerization) (Wu et al., 2002). Đa hình tại vị trí acid amin 487 cho phép xác định 5 phân typ P – ala P – thr, V – val, V – leu, V – pro (P: prototype; V: variant), liên quan đến lưu hành EBV trong mô, máu và dịch họng (Bhatia et al., 1996). Theo nghiên cứu gần đây, EBV phân lập ở vùng Nam Trung Quốc chủ yếu là V – val (Zhang et al., 2004; Mai et al., 2007), đóng vai trò quan trọng tăng cường sao chép đối với EBNA – 1 (Mai et al., 2010).
Bên cạnh nghiên cứu lâm sàng, tiến triển bệnh, EBV phân lập tại Việt Nam cũng đã được nghiên cứu về đặc điểm sinh học phân tử, trong đó có phân tích gen EBNA – 1 (Do et al., 2008; Nguyễn Đình Phúc, 2006). Tuy nhiên, việc xác định phân typ (subtyping) dựa trên biến đổi acid amin 487 chưa được đề cập đến tại Việt Nam. Mục tiêu của nghiên cứu này là: Xác định các phân typ EBV qua phân tích đặc điểm cấu trúc phân tử EBNA – 1 có trong các mẫu bệnh phẩm NPC của bệnh nhân Việt Nam. So sánh với các phân typ đã được biết trên thế giới để bước đầu xác định đặc điểm sinh học, dịch tễ học phân tử EBV ở các bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại Việt Nam.
I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân tích đa hình tại vị trí acid amin 487 của EBNA – 1 để xác định các phân typ prototype và variant ở 22 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ung thư vòm họng (NPC) nhập viện tại Hải Phòng, Hà Nội, Đà Nẵng và TP Hồ Chí Minh.
1. Mẫu bệnh phẩm và xử lý cho nghiên cứu
Mẫu tươi thu bằng phương pháp sinh thiết, bảo quản ở – 20oC, từ 4 vùng: i) mẫu Hà Nội, ký hiệu: HN và EB; ii) mẫu Hải Phòng, ký hiệu HP; iii) mẫu TP Hồ Chí Minh, ký hiệu S; iv) mẫu Đà Nẵng (miền Trung), ký hiệu: MT.
DNA tổng số được tách chiết sử dụng bộ kit của hãng Bionner (Hàn Quốc). Tóm tắt như sau: nghiền mẫu thành huyễn dịch; cho proteinase K, ủ và cho RNase. Cho dung môi GC, ủ ở 700C, rồi cho Isopropanol, ly tâm để thu dịch. Chuyển lên cột lọc, ly tâm, loại bỏ dịch dưới. Cho dung môi W1, ly tâm, bỏ dịch dưới. Cho dung môi W2, ly tâm, bỏ dịch dưới. Chuyển cột sang ống Eppen- dorf mới, cho dịch tách EL, ly tâm, thu dịch bên dưới là DNA tổng số của mẫu, bảo quản ở – 200C. Kiểm tra DNA bằng điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide. DNA hiển thị là vạch sáng đạt tiêu chuẩn để thực hiện PCR.
2. Thực hiện PCR, giải trình tự, xử lý số liệu
Đoạn gen EBNA – 1 (khoảng 0,76 kb) thu được bằng PCR với khuôn là DNA tổng số, sử dụng cặp mồi: EBK1F: 5 GTCATCATCATCCGGGTCTC 3 và EBVR: 5 CGATTGAGGGCGTCTCCTAAC 3. Chuỗi gen được thu nhận sau khi giải trình tự trực tiếp sản phẩm, hoặc sau khi tách dòng được xử lý bằng chương trình SeqEd1.03, sắp xếp bằng AssemblyLIGN 1.9 và MacVector 8.2 (Accelrys Inc.), so sánh đối chiếu bằng chương trình GENEDOC
2.5. Thành phần acid amin được thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (vi khuẩn, bacterial code) có trong Ngân hàng gen.
EBNA – 1 liên quan mật thiết đến ung thư vòm mũi họng (NPC) và tàng nhiễm virus. Đa hình tại vị trí acid amin 487 cho phép xác định 5 phân typ: P – ala, P – thr, V – val, V – leu, V – pro (P: prototype; V: Variant). Cần làm sáng tỏ trong mẫu bệnh phẩm NPC của bệnh nhân Việt Nam có bao nhiêu phân typ, thuộc loại nào. Mục tiêu: phát hiện và xác định phân typ EBV bằng phương pháp phân tích đặc điểm phân tử EBNA – 1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: tách DNA, thực hiện PCR, thu nhận đoạn gen EBNA – 1 (0,76 kb); giải trình tự, so sánh; phân tích acid amin EBNA – 1, nhận định đa hình tại vị trí 487 để xác định phân typ trên 22 mẫu bệnh phẩm sinh thiết từ bệnh nhân mắc NPC nhập viện 4 vùng, gồm Hà Nội (6 mẫu), Hải Phòng (6 mẫu), Đà Nẵng (3 mẫu) và TP Hồ Chí Minh (7 mẫu). Kết quả: trong số 22 mẫu NPC của Việt Nam phát hiện 3 phân typ: P – ala, P – thr và V – val, chưa phát hiện V – leu và V – pro. Hà Nội có 4 mẫu V – val; 2 mẫu P – thr; Hải Phòng có 4 V – val, 1 P – ala, 1 P – thr; Đà Nẵng có 2 V – val, 1 P – thr; TP Hồ Chí Minh có 4 V – val, 2 P – ala, 1 P – thr. Kết luận: ba phân typ P – ala, P – thr và V – val tồn tại trong số 22 mẫu NPC, ngoại trừ P – ala chưa phát hiện ở Hà Nội, 3 vùng còn lại đều chứa cả 3 phân typ. Phân typ V – val gập ở tất cả bệnh phẩm, được xác nhận có thể có vai trò chính trong tiến triển ung thư (tumorigenesis) của NPC. Sàng lọc phân tử xác định phân typ EBNA – 1 là cần thiết vì có thể giúp cho định hướng chẩn đoán sớm và phòng chống NPC .
Thông tin này hy vọng sẽ gợi mở cho các bạn hướng tìm kiếm và nghiên cứu hữu ích