Xác định các đa hình của codon 72 trên gen TP53 bằng kỹ thuật PCR – RFLP

Các đa hình của codon 72 trên exon 4 của gen TP53 liên quan đến nguy cơ mắc một số bệnh ung thư ở người. Kỹ thuật PCR – RFLP đã được sử dụng rộng rãi để xác định các đa hình này. Đề tài được thực hiện nhằm các mục tiêu sau: (1) Hoàn thiện kỹ thuật PCR – RFLP với cặp mồi tự thiết kế để xác định các đa hình của codon 72 trên gen TP53; (2) Xác định tỷ lệ các đa hình của codon 72 trên gen TP53 ở nhóm người tình nguyện.
Chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu DNA tách chiết từ máu ngoại vi của 60 người tình nguyện gồm 29 nam và 31 nữ bằng kỹ thuật PCR – RFLP trong đó bước PCR được thực hiện với cặp mồi tự thiết kế bằng phần mềm FastPCR, bước RFLP được thực hiện với enzym Bsh1236I.
Kết quả: phương pháp PCR – RFLP mà chúng tôi đã hoàn thiện với cặp mồi tự thiết kế đủ tiêu chuẩn để xác định các đa hình của codon 72 trên gen TP53 một cách chính xác; tỷ lệ dị hợp tử Arginine/ Proline chiếm 53,33 %, đồng hợp tử Arginine/ Arginine chiếm 25 %, đồng hợp tử Prolin/ Proline chiếm 21,67 %.
1.    ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ khi được phát hiện vào năm 1979, vai trò của gen TP53 (tumor protein 53 gene) ngày càng được sáng tỏ. Gen TP53 của người nằm trên nhiễm sắc thể 17 ở vị trí 17p13.1 (dưới băng 1, băng 3, vùng 1) với kích thước 19198 bp, nó mã hóa phân tử protein p53 gồm 393 acid amin. TP53 là một gen ức chế u, nó được coi như là “người giám hộ” genome người bởi có vai trò rất quan trọng trong ngăn ngừa ung thư.
Các biến dị di truyền trên gen liên quan đến hơn 50 % các loại ung thư ở người, trong đó sự đa hình (polymorphism) của codon 72 trên exon 4 của gen (sẽ mã hóa acid amin hoặc Arginine nếu mã là CGC hoặc Proline nếu mã là CCC) là phổ biến và được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Sự đa hình của codon 72 là yếu tố quyết định đến tính nhạy cảm của cơ thể vật chủ đối với nguy cơ mắc bệnh ung thư, đặc biệt là một số ung thư có tỉ lệ cao ở người như ung thư phổi, ung thư tiền liệt tuyến (gặp phổ biến nhất ở nam giới), ung thư cổ tử cung (gặp phổ biến thứ hai ở nữ giới)… Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng nếu codon 72 ở dạng đồng hợp tử Proline/ Proline sẽ có nguy cơ cao mắc ung thư phổi và ung thư bàng quang, nhưng lại làm giảm nguy cơ mắc ung thư tiền liệt tuyến. Trong khi đó ở dạng Arginine, phân tử protein của nó sẽ dễ bị thoái biến bởi protein E6 của human papillomavirus (HPV) hơn là ở dạng Proline, do đó làm tăng nguy cơ mắc một số ung thư liên quan đến HPV như ung thư cổ tử cung, ung thư thực quản, ung thư thanh quản, ung thư vòm miệng…
Đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để xác định sự đa hình của codon 72 trên gen TP53 như kỹ thuật Southern blotting, xác định trình tự DNA, kỹ thuật PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đối với Arginine (CGC) và Proline (CCC), hoặc kỹ thuật PCR – RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism); trong đó kỹ thuật PCR – RFLP tỏ ra nhiều ưu điểm hơn, bởi không những cho kết quả chính xác mà thao tác ít phức tạp, tiết kiệm thời gian, và chi phí ít tốn kém hơn.
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR – RFLP trong xác định đa hình codon 72 của gen TP53 là: trước tiên khuếch đại đoạn DNA của gen TP53 có chứa codon 72 bằng kỹ thuật PCR, sau đó tiến hành cắt sản phẩm PCR bằng Bsh1236I, là enzym cắt hạn chế có vị trí cắt đặc hiệu tại “5’…CGCG…3’ ”. Một sự thay đổi trình tự nucleotide của codon 72 từ CGC thành CCC (Arginine thành Proline) hoặc ngược lại sẽ làm vị trí cắt tương ứng của enzym trở thành vị trí không cắt hoặc ngược lại, từ đó làm thay đổi chiều dài sản phẩm cắt thu được, mà có thể phát hiện dễ dàng bằng cách điện di trên gel agarose.
Hiện nay, tại Thừa Thiên Huế nói riêng cũng như ở Việt Nam nói chung chưa có tài liệu nào công bố về công trình nghiên cứu sự đa hình của codon 72 trên gen TP53. Vì vậy việc hoàn thiện kỹ thuật sinh học phân tử PCR-RFLP để xác định sự đa hình của codon 72 trên gen TP53 có vai trò rất quan trọng. Mặt khác, sự phân bố các đa hình Arginine/ Arginine, Proline/ Proline và Arginine/ Proline trong quần thể người bình thường là cơ sở để đánh giá nguy cơ ung thư cho các nghiên cứu sâu hơn. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Xác định các đa hình của codon 72 trên gen TP53 bằng kỹ thuật PCR – RFLP“
Với các mục tiêu sau:
1.     Hoàn thiện kỹ thuật PCR – RFLP với cặp mồi tự thiết kế để xác định các đa hình của codon 72 trên gen TP53.
2.    Xác định tỷ lệ các đa hình của codon 72 trên gen TP53 ở nhóm người tình nguyện