Xác định đột biến gen GLA, GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Fabry và Pompe

Luận án tiến sĩ y học Xác định đột biến gen GLA, GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Fabry và Pompe.Fabry và Pompe là hai bệnh di truyền hiếm gặp thuộc nhóm bệnh liên quan tới rối loạn dự trữ các chất trong tiêu thể (lysosomal storage diseases- LSDs). Đây là một nhóm gồm trên 50 bệnh di truyền hiếm gặp do rối loạn chuyển hóa là hậu quả của sự suy giả m chức năng của tiêu thể.
LSDs thường là hậu quả của sự thiếu hụt của một enzyme duy nhất cần thiết cho chuyển hóa lipid, glycoprotein hoặc mucopolysaccharides.

Fabry là bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X còn Pompe là bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường. Nguyên nhân của bệnh đã được xác định là do đột biến gen GLA, GAA dẫn đến sự thiếu hụt tương ứng acid alpha-galactosidase và acid alpha-glucosidase, là những enzyme tiêu hóa của tiêu thể.1,2Sự thiếu hụt enzyme này dẫn đến sự tích tụ của glycerophospholipid và glycogen có cấu trúc bình thường trong tiêu thể và tế bào chất. Sự tích tụ quá mức các chất này trong tiêu thể sẽ làm gián đoạn hoạt động bình thường của các cơ quan khác trong tế bào và dẫn đến tổn thương tế bào.3,4Rất nhiều đột biến gen GLA, GAA đã được ghi nhận là đột biến gây bệnh, các đột biến mới vẫn tiếp tục được nghiên cứu và báo cáo.
Mặc dù tỉ lệ mắc bệnh là không cao khoảng 1 trường hợp cho 40.000 – 50.000 dân5nhưng hầu hết bệnh gây tử vong sớm vì suy hô hấp và suy tim. Tỷ lệ này trên nhóm nguy cơ cao, người bệnh có gan to, lách to chưa rõ nguyên nhân, cao hơn rất nhiều, là khoảng 1/400. Tuy nhiên nếu được phát hiện sớm thì nguy cơ tử vong có thể được giảm đáng kể bởi liệu pháp thay thế enzyme (ERT) và các điều trị hỗ trợ khác. Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện một tỷ lệ đáng kể người bệnh Fabry với những triệu chứng không điển hình, khởi phát muộn (sau 40 tuổi), được coi là các biến thể của Fabry: thể tim và thể thận.
Fabry và Pompe đều là các bệnh di truyền, do đó việc sàng lọc và phát hiện sớm các thành viên gia đình của bệnh nhân mang đột biến gen GLA, GAA là rất cần thiết để đưa ra tư vấn di truyền phù hợp, hạn chế sinh ra những đứa trẻ bị bệnh. Tại Việt Nam, có rất ít các nghiên cứu về đột biến gen GLA, GAA ở các bệnh nhân Fabry và Pompe, cũng như xác định đột biến ở các thành viên gia đình. Với những lý do trên đề tài “Xác định đột biến gen GLA, GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Fabry và Pompe‘’”được tiến hành với ba mục tiêu sau:
1.    Xác định đột biến gen GLA, GAA trên người bệnh Fabry và Pompe.
2.    Phát hiện người lành mang gen bệnh trên các thành viên gia đình người bệnh.
3.    Mô tả biểu hiện lâm sàng và cận lâm sàng của người bệnh mắc bệnh Pompe và Fabry.

MỤC LỤC
ĐẶT VAN Đề    1
CHƯƠNG 1. Tổ NG QUAN TA I LIềU    3
1.1.    Rố i loạn dự trữ trong tiêu thể    3
1.1.1.    Đại cương    3
1.1.2.    Chẩn đoán LSDs    4
1.1.3.    Điều trị LSDs    5
1.1.4.    Các phương pháp sàng lọc bệnh LSDs    6
1.2.    Bệnh Fabry    7
1.2.1.    Biểu hiện lâm sàng của Fabry    8
1.2.2.    Di truyền học phân tử của Fabry    11
1.2.3.    Liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình    18
1.2.4.    Chẩn đoán và sàng lọc Fabry    21
1.3.    Bệnh Pompe    26
1.3.1.    Biểu hiện lâm sàng    của Pompe    28
1.3.2.    Di truyền học phân    tử của Pompe    28
1.3.3.    Mối liên quan giữa    kiểu gen và kiểu hình    31
1.3.4.    Chẩn đoán và sàng    lọc Pompe    32
1.4.    Các phương pháp sinh học phân tử trong xác định đột biến gen GLA,
GAA    34
1.4.1.    Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)    35
1.4.2.    Giải trình tự gen trực tiếp    36
1.4.3.    Giải trình tự gen thế hệ mới NGS    37
1.4.4.    Dự đoán khả năng gây bệnh của các đột biến mới bằng các phần
mềm tin sinh học    37
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIềN CứU    40
2.1.    Đối tượng nghiên cứu    40
2.2.    Thời gian và địa điểm nghiên cứu    41
2.3.    Phương pháp nghiên cứu    42 
2.3.1.    Thiết kế nghiên cứu    42
2.3.2.    Cỡ mẫu nghiên cứu    42
2.3.3.    Phương pháp thu thập mẫu    42
2.3.4.    Các biến số nghiên cứu    44
2.3.5.    Sơ đồ nghiên cứu    45
2.3.6.    Phương tiện nghiên cứu    46
2.3.7.    Quy trình kỹ thuật đo hoạt độ enzyme     50
2.3.8.    Quy trình giải trình tự trực tiếp tìm đột biến gen GLA và GAA … 52
2.4.    Thu thập và xử lý số liệu    58
2.4.1.    Công cụ thu thập số liệu    58
2.4.2.    Quy trình thu thập số liệu    58
2.4.3.    Xử lý số liệu    58
2.4.4.    Khống chế sai số    59
2.5.    Đạo đức trong nghiên cứu    59
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU    60
3.1.    Đặc điểm chung của các đối tượng tham gia nghiên cứu    60
3.1.1.    Bệnh Fabry    60
3.1.2.    Bệnh Pompe    61
3.2.    Kết quả đo hoạt độ enzyme    62
3.2.1.    Hoạt độ enzyme GLA của các người bệnh nghi ngờ Fabry    62
3.2.2.    Kết quả hoạt độ enzyme GAA của các người bệnh nghi ngờ Pompe… 63
3.3.    Kết quả phân tích gen tìm đột biến    64
3.3.1.    Kết quả phân tích gen GLA    64
3.3.2.    Kết quả giải trình tự gen các người bệnh nghi ngờ Pompe    71
3.4.    Phát hiện người lành mang gen trên các thành viên gia đình người bệnh…. 79
3.4.1.    Phát hiện người lành mang gen trên các thành viên gia đình
người bệnh Fabry    79
3.4.2.    Phát hiện người lành mang gen trên thành viên gia đình người
bệnh Pompe    83
3.5.    Đặc điểm lâm sàng của người bệnh Fabry và Pompe    93
3.5.1.    Đặc điểm lâm sàng của người bệnh Fabry    93
3.5.2.    Đặc điểm lâm sàng của người bệnh Pompe    93
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN    96
4.1.    Đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu    96
4.1.1.    Đặc điểm chung về tuổi và giới của bệnh Fabry    96
4.1.2.    Đặc điểm chung về tuổi và giới của bệnh Pompe    98
4.2.    Biến đổi hoạt độ enzyme GLA, GAA của các người bệnh tham gia
nghiên cứu    98
4.2.1.    Hoạt độ enzyme GLA     98
4.2.2.    Hoạt độ enzyme GAA của    các    người bệnh nghi    ngờ Pompe    100
4.3.    Các đột    biến gen GLA, GAA ở    người bệnh Fabry    và    Pompe    100
4.3.1.    Các    đột biến gen GLA    100
4.3.2.    Các    đột biến gen GAA    103
4.4.    Phát hiện người lành mang gen trên thành viên gia đình người bệnh
tham gia nghiên cứu    113
4.4.1.    Phát hiện người lành mang gen trên thành viên gia đình người
bệnh Fabry      113
4.4.2.    Phát hiện người lành mang gen trên các thành viên gia đình
người bệnh Pompe    114
4.5.    Biểu hiện lâm sàng của người bệnh Fabry và Pompe    123
4.5.1.    Biểu hiện lâm sàng của người bệnh Fabry    123
4.5.2.    Đặc điểm lâm sàng của bệnh Pompe    124
KẾT LUẬN    127
KHUYẾN NGHỊ    128
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1:    Phân bố các loại đột biến gen GLA    15
Bảng 1.2:    Các SNP của gen GLA    17
Bảng 1.3.    Phân bố các loại đột biến gen GAA    30
Bảng 2.1.    Trình tự mồi của gen GLA sử dụng trong nghiên cứu    48
Bảng 2.2.    Trình tự mồi để khuếch đại gen GAA    49
Bảng 2.3:    Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại các exon gen GLA …    53
Bảng 2.4:    Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen GLA    54
Bảng 2.5.    Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự gen GLA    55
Bảng 2.6.    Chu trình nhiệt phản ứng PCR cho giải trình tự gen GLA    55
Bảng 2.7:    Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen GAA    56
Bảng 2.8:    Chu trình nhiệt khuếch đại gen GAA    56
Bảng 2.9:    Thành phần phản ứng PCR giải trình tự gen GAA    57
Bảng 2.10:    Chu trình nhiệt PCR giải trình tự gen GAA    57
Bảng 3.1:    Phân bố theo giới của nhóm người bệnh tham gia nghiên    cứu    ..    61
Bảng 3.2:    Phân bố theo tuổi khởi phát của các người bệnh Pompe    trong
nghiên cứu    61
Bảng 3.3:    Phân bố theo giới của các người bệnh Pompe    trong    nghiên cứu…    62
Bảng 3.4:    Kết quả đo hoạt độ enzyme GLA    62
Bảng 3.5:    Kết quả đo hoạt độ enzyme GAA    64
Bảng 3.6:    Kết quả giải trình tự gen GLA của    27    mẫu    có    hoạt    độ    enzyme
thấp nhất    66
Bảng 3.7. Dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến bằng các phầm mềm tin sinh học    69
Bảng 3.8:    Kết quả hoạt độ enzyme theo loại đột biến    70
Bảng 3.9:    Kết quả giả trình tự gen GAA của các đối tượng nghiên cứu …. 73
Bảng 3.10. Tần suất xuất hiện các đột biến trong nghiên cứu    76
Bảng 3.11. Kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến c.625T>C
bằng các phần mền tin sinh học    77
Bảng 3.12:    Kết quả đo hoạt độ enzyme GLA từ mẫu máu toàn phần    79
Bảng 3.13:    Kết quả đo hoạt độ enzyme GLA từ giấy thấm DBS    80
Bảng 3.14:    Kết quả đo hoạt độ enzyme và kết quả giải trình tự exon 1 của
gia đình người bệnh mã số VN.06    82
Bảng 3.15:    Tỷ lệ các thành viên mang đột biến qua các thế hệ    92
Bảng 3.16:    Triệu chứng lâm sàng khởi phát của các người bệnh    93
Bảng 3.17: Biến đổi chỉ số tim ngực và LVMI trên Xquang tim phổi và
siêu âm tim    94
Bảng 3.18: Kết quả hoạt độ enzyme CK, ALT của các người bệnh trong nghiên cứu    95 
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1:    Hình ảnh tế bào với tiêu thể bị tích đọng    4
Hình 1.2:    Hình ảnh tổn thương da do Fabry    10
Hình 1.3:    Cấu trúc alpha-galactosidase ở người    11
Hình 1.4:    Phân bố các đột biến điểm gây bệnh Fabry trên các exon    của
gen GLA (theo HGMD)    16
Hình 2.1:    Các phản ứng enzyme trong đo khối phổ song song GLA    51
Hình 3.1:    Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen GLA của mẫu
BN mã số FB64    65
Hình 3.2:    Hình ảnh biến thể 5’UTR -12G>A    68
Hình 3.3:    Kết quả đột biến c.178C>T, (p.Pro60Ser) của người bệnh    mã
số FB64    68
Hình 3.4:    Hình ảnh minh họa sử dụng công cụ PolyPhen-2 để dự đoán
khả năng gây bệnh của    đột biến c.178C>T    69
Hình 3.5:    Hình ảnh minh họa sử dụng công cụ MutationTaster để dự
đoán khả năng gây bệnh của đột biến c.178C>T    70
Hình 3.6:    Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi khuếch đại exon14
gen GAA    72
Hình 3.7:    Hình ảnh đột biến gen của người bệnh mã số Pom11.0    75
Hình 3.8:    Hình ảnh kết đột biến c.1411-1414delGAGA ở người bệnh
Pom20.4 và Pom20.7    75
Hình 3.9:    Hình ảnh đột biến chỗ nối trên intron 14 của người bệnh mã
số Pom12.0    76
Hình 3.10: Hình ảnh minh họa kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến c.625T>C bằng phần mềm PolyPhen2    78
Hình 3.11: Hình ảnh minh họa kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến c.625T>C bằng phần mềm MutationTaster    78
Hình 3.12: Phả hệ của gia đình mã số VN.06    81
Hình 3.13:    Phả    hệ gia đình mã số Pom16    83
Hình 3.14:    Phả    hệ gia đình mã số Pom17    85
Hình 3.15:    Phả    hệ gia đình mã số Pom18    86
Hình 3.16:    Phả    hệ gia đình mã số Pom19    87
Hình 3.17:    Phả    hệ gia đình mã số Pom20    88
Hình 3.18:    Phả    hệ gia đình mã số Pom21    89
Hình 3.19.    Phả    hệ gia đình mã số Pom22    90
Hình 3.20:    Phả    hệ gia đình mã số VN.0055    91