Xác định đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng
Luận văn thạc sĩ y học Xác định đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng.Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là ung thư hay gặp ở các nước phát triển, tỷ lệ mắc đứng hàng thứ hai sau ung thư phổi. Ở khu vực Đông Nam Á,hàng năm có hơn 300.000 bệnh nhân UTĐTT mới mắc với gần 200.000 trường hợp tử vong [1]. Các nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy UTĐTT đứng hàng thứ năm sau ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư vú ở nữ giới và ung thư vòm, với tỷ lệ mắc khoảng 7,5/100.000 dân/năm, tỷ lệ nam/nữ là 1,4/1 [2].
Hiện nay, sự phát triển của ngành nội soi kết hợp sinh thiết để xét nghiệm mô bệnh học đã giúp cho bệnh UTĐTT được phát hiện sớm hơn, từ đó giúp bệnh có tiên lượng tốt hơn [3].
Ở Việt Nam, hiện đã có nhiều công trình nghiên cứu UTĐTT, về tỷ lệ mắc bệnh, nguyên nhân, một số phương pháp chẩn đoán và điều trị mà chưa đi sâu nghiên cứu cơ chế phát sinh ung thư hay sự tương tác điều hòa gen và protein trong khối u [1],[4]. Các nước có nền y học hiện đại đã áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân ung thư và đem lại những kết quả nổi bật. Khoa học đã xác định được sự ảnh hưởng của các con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào cũng như sự tương tác gen đối với quá trình sinh trưởng, biệt hóa và chết theo chương trình của tế bào. Mỗi một biến đổi gen có thể làm thayđổi hoạt động sống của tế bào, biến một tế bào lành thành một tế bào ác tính hoặc gây chết tế bào [4],[5]. Bên cạnh đó, các biến đổi gen cũng làm các tế bào trở nên nhạy cảm hoặc kháng lại các tác nhân ngoại bào như các thuốc điều trị ung thư. Đây là cơ sở để các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng các loại thuốc mới, tác động trực tiếp lên các thụ thể tế bào nhằm ức chế trực tiếp sự phát triển của tế bào ung thư, gọi là liệu pháp điều trị trúng đích [6],[7],[8]. Phương pháp này có rất nhiều ưu điểm như liều điều trị thấp, ít độc hại, hiệu quả được nâng cao một cách rõ rệt , thể trạng bệnh nhân và thời gian sống của bệnh nhân tốt hơn so với các phương pháp truyền thống như hóa trị, xạ trị.
Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy mức độ đáp ứng với thuốc điều trị trúng đích ở bệnh nhân UTĐTT phụ thuộc phần lớn vào tình trạng một số gen như KRAS, BRAF, NRAS [9],[12],[13]. Trong bệnh UTĐTT, đột biến gen KRAS chiếm tỉ lệ cao nhất khoảng 35% – 45%, đột biến BRAF chiếm khoảng 10% – 15% còn đột biến NRAS chiếm khoảng 3% – 6% [12],[14],[15],[16]. Tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu tiến hành xác định đột biến gen KRAS, BRAF tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào tiến hành xác định đột biến cả 3 gen KRAS, BRAF và NRAS trên bệnh nhân UTĐTT. Hiện nay, số lượng bệnh nhân mắc UTĐTT ngày càng tăng, trên thị trường đã có một số dược phẩm điều trị đích được lưu hành, việc lựa chọn phác đồ điều trị phù
hợp cũng như theo dõi hiệu quả của liệu pháp điều trị đích phải dựa trên việc xác định tình trạng các gen KRAS, BRAF và NRAS.Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài nghiên cứu ‘‘Xác định đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng’’ được thực hiện với hai mục tiêu sau:
1. Áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen xác định những đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS có ý nghĩa quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị đích ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng.
2. Xác định tỉ lệ các dạng đột biến trên của các gen KRAS, BRAF, NRAS ở nhóm nghiên cứu
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………………….. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………….. 3
1.1. Tổng quan về ung thư đại trực tràng ……………………………………………… 3
1.1.1. Dịch tễ …………………………………………………………………………………. 3
1.1.2. Cơ chế bệnh sinh …………………………………………………………………… 4
1.1.3. Chẩn đoán …………………………………………………………………………….. 7
1.1.4. Điều trị UTĐTT ………………………………………………………………….. 12
1.1.5. Tiên lượng bệnh ………………………………………………………………….. 14
1.2. Vai trò của gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng 14
1.2.1. Con đường tín hiệu nội bào liên quan đến protein RAS/RAF ……. 14
1.2.2. Các loại đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại
trực tràng …………………………………………………………………………… 16
1.2.3. Vai trò của đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong liệu pháp điều
trị trúng đích bệnh UTĐTT ………………………………………………….. 20
1.3. Các kỹ thuật xác định đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS……………… 22
1.3.1. Kỹ thuật PCR ……………………………………………………………………… 22
1.3.2. Phương pháp giải trình tự gen ……………………………………………….. 23
1.3.3. Kỹ thuật PCR-RFLP ……………………………………………………………… 27
1.3.4. Kỹ thuật Scorpions ARMS ……………………………………………………. 28
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 30
2.1. Đối tượng nghiên cứu ………………………………………………………………… 30
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn …………………………………………………………….. 30
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ………………………………………………………………. 30
2.2. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………………. 30
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ……………………………………………………………… 30
2.2.2. Phương pháp tiến hành nghiên cứu ………………………………………… 30
2.3. Dụng cụ, trang thiết bị, hóa chất trong nghiên cứu ………………………… 32
2.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị ………………………………………………………….. 32
2.3.2. Hóa chất dùng trong nghiên cứu ……………………………………………. 32
2.4. Các quy trình kỹ thuật ………………………………………………………………… 34
2.4.1. Thu thập mẫu ………………………………………………………………………. 34
2.4.2. Tách chiết DNA ………………………………………………………………….. 34
2.4.3. Khuếch đại exon 2 gen KRAS, exon 15 gen BRAF và exon 2, exon
3 gen NRAS bằng phương pháp PCR …………………………………… 37
2.4.4. Giải trình tự gen đoạn exon 2 gen KRAS, exon 15 gen BRAF và
exon 2, exon 3 gen NRAS …………………………………………………… 41
2.5. Phương pháp xử lý số liệu ………………………………………………………….. 44
2.6. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu ………………………………………………… 45
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………………………… 46
3.1. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu mô ung thư …………………………………. 46
3.2. Kiểm tra chất lượng DNA bằng cặp mồi gen nội chuẩn GAPDH ……. 48
3.3. Kết quả khuếch đại exon 2 gen KRAS, exon 15 gen BRAF và exon 2,
exon 3 gen NRAS ……………………………………………………………………. 48
3.4. Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen ………………. 50
3.4.1. Kết quả giải trình tự gen KRAS …………………………………………….. 50
3.4.2. Kết quả giải trình tự gen BRAF …………………………………………….. 53
3.4.3. Kết quả giải trình tự gen NRAS …………………………………………….. 54
3.5. Kết quả xác định tỷ lệ đột biến gen KRAS, BRAF và NRAS …………. 55
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN …………………………………………………………………. 58
4.1. Bàn luận về kỹ thuật xác định đột biến ………………………………………… 58
4.2. Bàn luận về tỷ lệ đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh
UTĐTT …………………………………………………………………………………… 62
KẾT LUẬN ………………………………………………………………………………………. 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC