Xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA và phát hiện người lành mang gen bệnh

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne là một bệnh lý cơ do di truyền thường gặp nhất, được phát hiện ở tất cả các chủng tộc khác nhau trên thế giới. Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai. Hầu hết trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng yếu cơ, biểu hiện bằng khó đi lại, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang. Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, mất khả năng đi lại vào lứa tuổi 12 và thường tử vong ngoài 20 tuổi do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [146].

Loạn dưỡng cơ Duchenne là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên bởi đột biến gen dystrophin. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể X ở locus Xp21, có chiều dài khoảng 2400 kb gồm 79 exon với 7 promoter khác nhau. Đây là một trong những gen lớn nhất của người được phát hiện cho đến nay. Gen này sao mã ra mRNA 14kb và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là dystrophin. Protein này có mặt ở màng bào tương của tế bào cơ và có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định màng, bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ. Khi gen bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne [96], [109].

Hiện nay, bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định. Dạng đột biến xóa đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm tỷ lệ 60%. Đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30%. Đột biến lặp đoạn, khoảng 10-15% [106]. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy đột biến xóa đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) là vùng trung tâm ở giữa gen (exon 43-60) và vùng tận cùng 5’ (exon 1-19) [91], [107]. Vì vậy, để tiết kiệm về kinh phí và thời gian trong việc phát hiện đột biến xóa đoạn gen, các tác giả thường sử dụng 19-25 cặp mồi tập trung đặc hiệu cho 19-25 exon trong vùng hay xảy ra xóa đoạn [7], [20], [69].

Những năm gần đây, nhờ vào sự phát triển của ngành sinh học phân tử, nhiều nhà khoa học nước ngoài cũng như trong nước đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện được đột biến gen dystrophin ở các bệnh nhân loạn dưỡng cơ

Duchenne. Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu thường tập trung vào xác định dạng đột biến xóa đoạn gen ở mức độ DNA và thường chỉ ưu tiên xác định đột biến trong 2 vùng trọng điểm [1], [7], [10]. Trong khi đó đột biến gen dystrophin có thể rải rác khắp 79 exon. Do vậy, các nghiên cứu trên thường bỏ sót đột biến ở những exon khác và cả đột biến xảy ra trong quá trình hoàn thiện các tiền mRNA.

Một điều cần lưu ý là để xác định đột biến xảy ra ở gen dystrophin bằng phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) ở mức độ DNA, chúng ta phải khuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, có nghĩa phải khuếch đại toàn bộ 79

exon để xác định đột biến. Trên phân tử DNA, các exon lại nằm xen kẽ với

các intron có kích thước quá lớn nên để khuếch đại 79 exon ở mức độ DNA người ta phải thiết kế 79 cặp mồi bắt cặp đặc hiệu ở hai đầu mỗi exon, điều này gây tốn kém cả về tài chính lẫn thời gian. Ngược lại, ở cấu trúc của

mRNA, các đoạn intron đã bị cắt bỏ và 79 exon nằm liên tục nhau. Do vậy, để khuếch đại toàn bộ chiều dài đoạn mRNA chứa đủ 79 exon, người ta chỉ cần dùng 15 cặp mồi đặc hiệu đã có thể khuếch đại được cả chiều dài đoạn gen dystrophin [9], [77], [129]. Như vậy, việc xác định đột biến ở mức độ RNA giúp tiết kiệm rất nhiều công sức, thời gian cũng như hóa chất.

Với những biểu hiện lâm sàng nặng nề cùng rối loạn về tinh thần và tử vong sớm do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne thực sự là một tai họa đối với bản thân người bệnh và là gánh nặng của gia đình cũng như của cộng đồng. Theo nhiều nghiên cứu, 2/3 bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne nhận gen di truyền từ người mẹ dị hợp tử, 1/3 bệnh nhân bị đột biến mới phát sinh [66]. Do vậy, việc chẩn đoán người mẹ dị hợp tử, chẩn đoán trước sinh phát hiện các thai nhi bất thường và ngăn chặn bệnh bằng phương pháp phá thai chủ động là giải pháp hiệu quả nhất để làm giảm tỷ lệ mắc bệnh [93], [107].

Ở Việt Nam, năm 2005, Nguyễn Thị Trang và cộng sự nghiên cứu về lâm sàng, phân tích phả hệ, đo hoạt độ của creatine kinase trong chẩn đoán người mang gen bệnh và phát hiện được khoảng 50% trường hợp nghiên cứu có khả năng là người mang gen bệnh [20]. Tuy nhiên, những kết quả trên chỉ mang tính chất gợi ý, không có cơ sở về tổn thương di truyền và chưa đủ sức thuyết phục để thực hiện tư vấn di truyền.

Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA và phát hiện người lành mang gen bệnh” được tiến hành với các mục tiêu sau:

1. Xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn

dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA.

2. Phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái và dì) trong gia đình của bệnh nhân đã được xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin.

3. Bước đầu thực hiện chẩn đoán trước sinh cho những thai phụ dị hợp tử mang gen dystrophin đột biến xóa đoạn.

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan

Danh mục các chữ viết tắt và các ký hiệu

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, biểu đồ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD 4

1.2. Đặc điểm của bệnh DMD 5

1.2.1. Biểu hiện lâm sàng của DMD 5

1.2.2. Xét nghiệm cận lâm sàng 6

1.2.3. Tần số của bệnh 9

1.2.4. Di truyền học bệnh DMD 9

1.2.5. Điều trị bệnh DMD 10

1.2.6. Phòng bệnh DMD 12

1.3. Cơ chế bệnh sinh và các dạng đột biến gen dystrophin 13

1.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen dystrophin 13

1.3.2. Cấu trúc và chức năng của protein dystrophin 14

1.3.3. Cơ chế bệnh sinh của DMD 15

1.3.4. Các dạng đột biến cấu trúc của gen dystrophin 16

1.4. Các phương pháp phát hiện đột biến gen dystrophin 17

1.4.1. Kỹ thuật PCR 17

1.4.2. Phương pháp Southern blot 21

1.4.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) 23

1.4.4. Phương pháp MLPA 24

1.4.5. Kỹ thuật giải trình tự gen bằng máy tự động 27

1.5. Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD

1.5.1. Phương pháp chẩn đoán trước sinh lấy mẫu xâm phạm thai

1.5.2. Phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai

1.6. Tình hình nghiên cứu bệnh DMD ở Việt Nam

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.2.1. Dụng cụ

2.2.2. Hóa chất

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Quy trình lấy mẫu

2.3.2. Quy trình xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin ở mức độ mRNA

2.3.3. Quy trình phát hiện người lành mang gen dystrophin đột biến xóa đoạn….

2.3.4. Quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh DMD

2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin ở mức độ mRNA

3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA

3.1.2. Kết quả chẩn đoán đột biến xóa đoạn gen dystrophin ở mức độ mRNA

3.1.3. Kết quả về tỷ lệ đột biến xóa đoạn và phân bố vị trí các exon bị xóa

đoạn trên gen dystrophin

3.2. Phát hiện người lành mang gen dystrophin bị đột biến xóa đoạn

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA

3.2.2. Kết quả xác định người lành mang gen bệnh

3.2.3. Tỷ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh

3.2.4. Kết quả phân tích phả hệ của các gia đình nghiên cứu

3.2.5. Kết quả định lượng hoạt độ CK của các thành viên nữ

3.3. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh DMD

3.3.1. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình bệnh nhân mã số 20

3.3.2. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình bệnh nhân mã số 39

Chương 4: BÀN LUẬN 80

4.1. Xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin ở mức độ mRNA 80

4.1.1. Kỹ thuật tách chiết RNA và tổng hợp cDNA 80

4.1.2. Phản ứng nestedPCR xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin 82

4.1.3. Tỷ lệ đột biến xóa đoạn gen dystrophin của các bệnh nhân DMD 87

4.1.4. Phân bố vị trí các exon bị đột biến xóa đoạn 90

4.2. Phát hiện người lành mang gen dystrophin bị đột biến xóa đoạn 92

4.2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA 92

4.2.2. Phản ứng xác định người lành mang gen 93

4.2.3. Tỷ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh 99

4.2.4. Phân tích phả hệ của các gia đình nghiên cứu 100

4.2.5. Kết quả định lượng hoạt độ enzym CK 101

4.3. Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD 102

KẾT LUẬN 109

KIẾN NGHỊ 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC