Xác định Gen aap, aggr, và asta của các chủng Enteroaggregative Escherichia Coli

Tiêu chảy là một trong những nguyên nhân thường gặp nhất về tỷ lệ mắc và tử vong cho trẻ em trên toàn thế giới; đặc biệt, ở những nước đang phát triển. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ở các nước này, hàng năm có khoảng 1,3 tỷ lượt trẻ em bị tiêu chảy và từ 4 đến 10 triệu trường hợp tử vong, phần lớn là trẻ em dưới 5 tuổi [4, 5]. Trong số các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy, các E. coli gây tiêu chảy (diarrheagenic E. coli-DEC) đóng vai trò quan trọng. Chóng được chia thành năm nhóm chính dựa trên đặc điểm lâm sàng của bệnh tiêu chảy, dịch tễ học, typ huyết thanh, và sự có mặt của các yếu tố độc lực. Trong đó, các yếu tố độc lực có ý nghĩa quyết định. Chúng là E. coli bám dính kết tập đường ruột (enteroaggRegative E. coli- EAEC), E. coli gây xuất huyết đường ruột (enterohaemorrhagic E. coli-EHEC), E. coli xâm nhập đường ruột (enteroinvasive E. coli-EIEC), E. coli gây bệnh lý đường ruột (enteropathogenic E. coli), và E. coli sinh độc tố ruột (enterotoxigenic E. coli-ETEC) [4]. EAEC là loại E. coli có kiểu cách bám dính kết tập (aggregative adherence – AA) trên tế bào Hep-2. Loại DEC này mới được phát hiện và nghiên cứu trong vòng 20 năm gần đây. Hiện nay, vi khuẩn này được quan tâm rất nhiều
+ Chủng E. coli làm chứng dương và  chứng âm: E. coli 17-2 và E. coli 11775 do GS Andrej Weintraub, Khoa Vi sinh lâm sàng, viện Karolin- ska, Thụy Điển cung cấp.
2.    Phương pháp nghiên cứu
+   Các sinh phẩm, vật liệu, và dụng cụ  máy móc dùng cho PCR.
+ Kỹ thuật PCR phát hiện gen aap, aggR và astA được áp dụng theo mô tả của Yamamoto, Cerna và vì chúng là  tác nhân quan trọng gây tiêu chảy. cộng sự  [1, 8]. Moi phản ưng PCR gồm  20μl các
Bệnh lý do EAEC gây ra có thể biểu hiện ở dạng tiêu chảy cấp, hoặc tiêu chảy mạn tính. Trong đó,thành phần  với  nồng  độ như  sau:  MgCl2,  2μM; dNTPs,  200μM  mỗi  loại,  AmpliTaq  polymerase,EAEC có mối liên quan chặt chẽ đến tiêu chảy0,025 UI; 3 cặp mồi đặc hieucho aap, aggR, astA,mạn tính ở trẻ em dưới 5 tuổi tại các nước đang 2,5 pmol/μl) (Promega, USA) và 2μl ADN mẫu. Chu phát triển. Các yếu tố độc lực của EAEC do các trình nhiet được thực hiện như sau: 950C/5 phút ; 40 gen mã hoá trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid. Trong số các gen này, aap, aggR, và astA được nghiên cứu khá nhiều trong cơ chế gây bệnh của EAEC [1, 4, 8]. Do vậy, tìm hiểu sự phân bố của các gen này có ý nghĩa trong việc phát triển các kỹ thuật chẩn đoán và hiểu thêm về cơ chế gây bệnh của chúng. Vì lý do trên, nghiên cứu này được tiến hành với 2 mục tiêu:
1.    Xác định tỷ lệ mang gen aap, aggR, astA ở các chủng EAEC.
2.    So sánh tỷ lệ mang gen aap, aggR, astA ở các EAEC phân lập được từ hai nhóm trẻ lành- trẻ bị tiêu chảy và theo nhóm tuổi .
I.    ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG    PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu
+ 86 chủng EAEC (68 chủng phân lập từ trẻ bị tiêu chảy và 18 chủng phân lập từ trẻ lành từ 0 đến 60 tháng  tuổi).  Các chủng  này đã  được  xác định bằng PCR trong nghiên cứu của Nguyễn Vũ Trung và cộng sự [5] và được bảo quản trong ngân hàng của Đề án bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, bộ môn Vi sinh y học, Đại học Y Hà Nội.chu kỳ gồm 950C/45 giây,  550C/45 giây, và 720C/45 giây, kết thúc bằng 720C/10 phút.
Quy trình được thực hện trên máy GeneAmp PCR system 9700 AB (Applied Biosystem, USA). 10μl sản phẩm PCR được dùng để điện di trên gel agarose 1,2% trong dung dịch đệm TAE ở hiệu điện thế 120 mV trong 30 phút bằng máy điện di. Các mẫu nghiên cứu được điện di cùng với chứng dương, chứng âm và thang ADN chuẩn để đối chiếu kết quả. Bản gel sau khi điện di được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide 1% trong 10 phút. Vớt bản thạch ra rồi ngâm vào nước cất 10 phút, sau đó đọc dưới máy soi gen Wealtec Corp Model-20 (USA). Kích cỡ các sản phẩm PCR: aap (310bp), aggR (457bp) vμ astA (111bp).