Xác định gien aap, aggr, và asta của các chủng etec, epec, eiec và e. coli không gây tiêu chảy

Tiêu chảy là một trong những nguyên nhân thường gặp nhất về tỷ lệ mắc và tử vong cho trẻ em trên toàn thế giới; đặc biệt, ở những nước đang phát triển. Theo Tổ chức Y tế thế giới, ở các nước này, hàng năm có khoảng 1,3 tỷ lượt trẻ em bị tiêu chảy và từ 4 đến 10 triệu trường hợp tử vong, phần lớn là trẻ em dưới 5 tuổi [1, 2]. Trong số các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy, các E. coli đóng vai trò quan trọng. Các DEC được chia thành năm nhóm chính dựa trên đặc điểm lâm sàng của bệnh tiêu chảy, dịch tễ học, typ huyết thanh, và sự có mặt của các yếu tố độc lực. Trong đó, các yếu tố độc lực có ý nghĩa quyết định. Chúng là E. coli bám dính kết tập đường ruột (enteroaggRegative E. coli-EAEC), E. coli gây xuất huyết đường ruột (enterohaemorrhagic E. coli- EHEC), E. coli xâm nhập đường ruột (enteroinvasive E. coli-EIEC), E. coli gây bệnh lý đường ruột (enteropathogenic E. coli), và E. coli sinh độc tố ruột (enterotoxigenic E. coli-ETEC) [3]. Các chủng E. coli gây bệnh bằng các cơ chế khác nhau được qui định bởi các yếu tố độc lực do các gien tương ứng mã hóa. Trong số các gien này, aap, aggR, và astA được nghiên cứu khá nhiều trong cơ chế gây bệnh của EAEC. Tuy nhiên, các gien này đôi khi còn có ở những chủng E. coli gây tiêu chảy khác ngoài EAEC. Đặc biệt, chúng còn có mặt cả ở những chủng E. coli được coi là không gây tiêu chảy. Đây là một vấn đề đang được quan tâm vì ngày càng có nhiều nghiên cứu tập trung vào việc các định những yếu tố có vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của tiêu chảy do E. coli. Thêm vào đó, nhiều chủng E. coli có mang những gien độc lực này nhưng chưa được xếp vào các nhóm E. coli gây tiêu chảy đã được thừa nhận. Do vậy, tìm hiểu sự phân bố của các gien này có ý nghĩa trong việc phân loại E. coli gây tiêu chảy, phát triển các kỹ thuật chẩn đoán và hiểu thêm về cơ chế gây bệnh của chúng. Vì lý do trên, nghiên cứu này được tiến hành với 2 mục tiêu:
1.    Xác định tỷ lệ mang gien aap, aggR, astA ở các chủng E. coli loại ETEC, EPEC và EIEC.
2.    Xác định tỷ lệ mang gien aap, aggR, astA ở các chủng E. coli không gây tiêu chảy.
II.    ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG    PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Đối tượng nghiên cứu
+  75  chủng  E.  coli  gây  tiêu  chảy  gồm  11 chủng EIEC, 50 chủng EPEC, 14 chủng ETEC và 100 chủng E. coli không gây tiêu chảy. Các chủng này đã được xác định bằng PCR qua nghiên cứu của Nguyễn Vũ Trung và cộng sự [2] và được bảo quản trong ngân hàng của Đề án bảo tồn nguồn gien vi sinh vật, bộ môn Vi sinh y học, trường Đại học Y Hà Nội.
+ Chủng E. coli làm chứng dương và chứng âm
E.    coli 17-2 và E. coli 11775 do GS Andrej Wein- traub, Khoa Vi sinh lâm sàng, Viện  Karolinska, Thụy Điển cung cấp.
2.    Phương pháp nghiên cứu
–    Các sinh phẩm, vật liệu, và dụng cụ máy móc dùng cho PCR.
–    Kỹ thuật PCR phát hiện gien aap, aggR  và astA được áp dụng theo mô tả của  Yamamoto, Cerna và cộng sự  [4, 5]. Mỗi ống PCR chứa 20μl các thành phần với nồng độ  như  sau: MgCl2, 2 mM;   dNTPs, 200 μM mỗi  loại, AmpliTaq poly- merase, 0,025 UI; 3 cặp  mồi đặc hiệu cho aap, aggR, astA, 2,5 pmol/μl)  (Promega, USA) và 2μl ADN mẫu. Chu trình  nhiệt được thực hiện như sau : 950C/5 phút; 40 chu kỳ gồm 950C/45 giây, 550C/45  giây,  và  720C/45  giây,  kết  thúc  bằng 720C/10 phút.
Quy trình được thực hện trên máy GeneAmp PCR system 9700 AB (Applied Biosystem, USA). 10 μl sản phẩm PCR được dùng để điện di trên gel agarose 1,2% trong dung dịch đệm TAE ở hiệu điện thế 120 mV trong 30 phút bằng máy điện di. Các mẫu nghiên cứu được điện di cùng với chứng dương, chứng âm và thang ADN chuẩn để đối chiếu kết quả. Bản gel sau khi điện di được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide 1% trong 10 phút. Vớt bản thạch ra rồi ngâm vào nước cất 10 phút, sau đó đọc dưới máy soi gien Wealtec Corp Model-20 (USA).
3.    Phân tích số liệu
–    Các số liệu được quản lý và phân tích bằng chương trình SPSS 13.
Test ÷2 được sử dụng để đánh giá sự khác biệt giữa hai tỷ lệ. Giá trị p < 0,05 được coi là  có ý nghĩa thống kê
Các gien aap, aggR, astA có vai trò quan trọng trong cơ chế gây bệnh của EAEC. Ngoài ra, chúng có thể còn có mặt cả ở những E. coli  khác. Mục tiêu: Xác định sự phân bố của gien aap, aggR, astA ở các chủng ETEC, EPEC, EIEC và E. coli không gây tiêu chảy. Đối tượng, phương pháp: 75 chủng E. coli gây tiêu chảy thuộc ba loại EIEC, EPEC, ETEC và 100 chủng E. coli không gây tiêu chảy. Kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để phát hiện các gien này. Kết quả: Cả ETEC, EPEC và EIEC đều mang các gien aap, aggR và astA với tỷ lệ từ 7% đến 72,7%. Tỷ lệ mang gien aap cao nhất gặp ở EIEC (72,7%), aggR gặp ở EIEC (45,5%), và astA ở ETEC (50%). 14% các chủng E. coli được coi là không gây tiêu chảy mang gien aggR và trên 30% các E. coli này mang gien aap và astA. Kết luận: Kết quả của nghiên cứu đã đóng góp vào hiểu biết thêm về sự phân bố của các gien aap, aggR, và astA ở các chủng ETEC, EPEC, và EIEC cũng như các chủngE. coli được coi là không gây tiêu chảy.