XÁC ĐỊNH HELICOBACTER PYLORI TRONG MANH SINH THIET DẠ DÀY-HÀNH TÁ TRÀNG VÀ PHÁT HIÊN ĐỘT BIỂN KHÁNG CLARITHROMYCIN BANG REAL-TIME PCR

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC XÁC ĐỊNH HELICOBACTER PYLORI TRONG MANH SINH THIET DẠ DÀY-HÀNH TÁ TRÀNG VÀ PHÁT HIÊN ĐỘT BIỂN KHÁNG CLARITHROMYCIN BANG REAL-TIME PCR TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TỈNH BẮC GIANG.Loét dạ dày tá tràng (LDDTT) là bệnh rất phổ biến và đã được y học biết đến từ rất lâu. Có rất nhiều giả thuyết về nguyên nhân gây bệnh. Tuy vậy, đến năm 1983, qua nhiều nghiên cứu, Marshall và Warren mới chứng minh được vai trò gây bệnh của Helicobacter pylori (H. pylori) trong LDDTT, từ đó, có rất nhiều công trình nghiên cứu về H. pylori ra đời, quan điểm điều trị LDDTT và kết quả điều trị đã thay đổi rất nhiều. Vơi sư phat triên cua ky thuật nôi soi tiêu hoa, hiên nay, để chẩn đoán và điều trị LDDTT đông nghĩa vơi viêc nôi soi xac định tôn thương va xet nghiêm xac định tinh trạng nhiễm H. pylori [1].

H. pylori là vi khuẩn với các đặc điểm : băt mau Gram (-); hình xoắn, hơi cong; sinh enzym urease ngoa i bao rât mạnh; đăc biêt, rât kho nuôi cây, đô nhay cua ky thuât nuôi cây thâp (50%), thơi gian tra kêt qua nuôi cây va kháng sinh đồ chậm (7 – 14 ngày).
Để xac đinh nhiễm H. pylori, hiện nay y học có thể sử dụng nhiều kỹ thuật, trong đo co hai nhom kỹ thuât chinh: Các kỹ thuật có sử dụng thủ thuật xâm lân, dưa vao nôi soi da day , lây manh sinh thiêt cho cac ky thuât như (test urease, mô bênh hoc , nhuôm soi, nuôi cây, các kỹ thuật PCR …). Thú hai la cac ky thuât không xâm lân như (test huyêt thanh IgM, đinh lương IgG, test hơi thơ, test tim H. pylori trong nươc tiêu va trong phân…). Môi ky thuât này đều có giá trị riêng trong xác định nhiễm H. pylori [1].
Real-time PCR phát hiện H. pylori trong manh sinh thiêt dạ dày dựa vào xác định những đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn, là kỹ thuật hiện đại, có đô nhay va đăc hiệu, cao (tư 95 – 100%), thơi gian tra kêt qua nhanh , bênh phâm không đoi hoi phai bảo quản đặc biệt . Ngoài ra, còn phát hiên được một số đôt biên liên quan đến khang khang sinh của vi khuẩn [1].
Do cac đăc điêm vê bênh LDDTT va H. pylori như trên, hiên nay, điêu trị LDDTT được hướng dẫn sử dụng t heo cac phac đô , bản chất là phối hợp
kháng sinh diệt H. pylori. Trong các phác đồ điều trị LDDTT và diệt H. pylori, clarithromycin là khang sinh chu yếu và được sử dung . Clarithro¬
mycin là thuốc gắn vào peptydyl transferase th uốc vung domain V và VI củà 23S rRNA H. pylori, làm ngừng tổng hợp protein vi khuẩn . H. pylori kháng lại clarithromycin bằng nhiều cợ chế , trong đo cợ chế chính là đốt biến thày thế mốt số nucleotid ợ gen 23 S rRNA làm giàm ài lư c gắn cua clarithromycin.
Hiến nay, H. pylori đà khàng lài clarithromycin rất nhiếu , tỷ lệ kháng thuốc ợ càc khu vực và ở các thời điểm khống đếu nhàu: Trung Quốc (65,4% – 2009); Mỹ và các nước Chấu Âu (> 20% – 2010); Ba Lan, Cameroon (gấn 50% – 2010); Viết: Nam (> 20% – 2009 – 2012), có những khu vực tại Việt Nam co > 50% chủng H. pylori kháng clarithromycin [2].
Bệnh viện đà khoa tỉnh Bắc Giang là bệnh viện tuyến cuối cùng củà ngành y tế tỉnh Bắc Giang. Tại đấy, các bệnh nhấn VLDDTT được chỉ định nội soi chẩn đoán. Khoa Vi sinh có các trang thiết bị đáp ứng nhu cầu về xét nghiến! trực tiếp, nuối cấy, phấn lập cũng như real-time PCR. Tuy nhiến, việc áp dụng real-time PCR trong xác định H. pylori trên lâm sàng còn rất hạn chế. Các bác sỹ thường chỉ định nhuộm soi và test urease cho xác định vi khuấn H. pylori trong mảnh sinh thiết dạ dày và kế đợn theo các phác đồ điếu tri. Hợn nưa, viếc nuối cấy và làm khàng sinh đố vợi H. pylori gặp nhiếu khó khặn do thời gian chờ kết quả dài và độ nhạy thấp.
Hiến nay, tại Bắc Giang chưa có cống trình nghiến cứu nào đánh giá vế H. pylori kháng kháng sinh, đặc biệt: là khàng clarithromycin.
Tư nhưng thưc tế trến, nhóm nghiên cưu tiến hành đế tài này nhắm muc tiêu:
1. Xác định H. pylori từ mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân loẻt dạ dày tá tràng bằng real-time PCR tại Bệnh viện đả khoa tỉnh Bắc Giang.
2. Xác định ty lế H. pylori co đột biến kháng clarithromycin bằng kỹ thuật real-time PCR.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tạ Long (2003). Bệnh lý dạ dày tá tràng và vi khuan Helicobacter pylori – NXB Y học, Hà Nội.
2. Đặng Ngọc Quý Huệ , Trần Văn Huy (2012). Cập nhật: vê H. pylori: đề kháng kháng sinh, chần đoan và điêu tri năm 2012. Tạp chỉ khoa học tiêu hoa Việt Nam – Tập IX – Sổ» 34 – 2014.
3. Bùi Khắc Hậu (2009) – Helicobacter pylori – Vi khuẩn Y học. NXB Giáo Dục, Hà Nội.
4. Francis Megraud, Philippe Lehours (2007). Helicobacter pylori Detection and Antimicrobial Susceptibility Testing. Clinical Microbio¬logy Reviews, Apr. 2007, p. 280-322. Vol. 20, No. 2.
5. Voon L. Chan, Philip M. Sherman, Billy Bourke (2006) – Bacterial genomes and infectious diseases – Humana press Inc 2006.
6. Peek, Jr. Dawn A. Israel, Nina Salama et al (2001). Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. The Journal of Clinical Investigation. March 2001. Volume 107. Number 5.
7. Van Doorn L-J, P M Schneeberger, N Nouhan et al (2000). Importance of Helicobacter pylori cagA and vacA status for the efficacy of antibiotic treatment – Gut 2000;46: 321-326
8. Yoshio Yamaoka, Tadashi Kodama, Oscar Gutterrez et al (1999). Relationship between Helicobacter pylori iceA, cagA, and vacA Status and Clinical Outcome: Studies in Four Different Countries. Journal of clinical microbiology, p. 2274-2279 Vol. 37, No. 7.
9. Yoshiyuki Ito, Wen Zhou, Shiho Yamazaki et al (2004). The diversity of vacA and cagA genes of Helicobacter pylori in East Asia. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 40 (2004) 81-87.
10. M. Kidd, J. C. Atherton, A. J. Lastovica et al (2001). Clustering of South African Helicobacter pylori Isolates from Peptic Ulcer Disease Patients Is Demonstrated by Repetitive Extragenic Palindromic-PCR Fingerprinting. Journal of clinical microbiology, p. 1833-1839 Vol. 39, No. 5.
11. Xu. Q, Martin J. Blaser, John P. Donahue et al (2000). Analysis of iceA1 transcription in Helicobacter pylori – Helicobacter. 2000 March, 5(1): 1-12. Blackwell Science, Inc.
12. X. G. Fan and T. G. L (1997). Growth of Helicobacter pylori in candle jars – J. Med. Microbiol. Vol. 46.
13. Shahid Khan, Asim Karim and Shaheryar Iqbal (2009). Helicobacter urease: Niche construction at the single molecule level. J. Biosci. 34.
14. James T. Neal, Tracy S. Peterson, Michael L. Kent et al (2013). H. pylori virulence factor CagA increases intestinal cell proliferation by Wnt pathway activation in a transgenic zebrafish model. Disease Models & Mechanisms 6, 802-810.
15. Kartar Singh, Uday C Ghoshal (2006). Causal role of Helicobacter pylori infection in gastric cancer: An Asian enigma. World J Gastroenterol, world Journal of Gastroenterology ISSN 1007-9327 wjg@wjgnet.com © 2006 The WJG Press. All rights reserved.
16. Howard W. Steer. Does necrosis have any role in gastric epithelial cell biology? Evidence to support a gastric holocrine epithelial cell secretion in Helicobacter pylori infection. Southamton SO16, 6YD, United Kingdom.
17. Manxhuka-Kerliu Suzana, Telaku Skender, Devolli-Disha Emine et al (2009). H. pylori Gastritis updated Sysney Classification Applied in our Masterial. Biol. Med. Sci, XXX/1 (2009). 45-60.
18. Manfred stolte, Alexander Meining (2001). The updated Sydney system: Classification and Grading of Gastritis as the basis of Diagnosis and Treatment. Gastroenterology Vol 15. No 9.
19. D Pantoflickova, D R Scott, G Sachs, G Dorta, A L Blum (2003). 13C urea breath test (UBT) in the diagnosis of Helicobacter pylori: why does it work better with acid test meals?. Gut 2003;52:933-937.
20. M. Baele, K. Van den Bulck, A. Decostere et al (2004). Multiplex PCR Assay for Differentiation of Helicobacter felis, H. bizzozeronii, and H. salomonis. Journal of clinical microbiology, p.1115-1122,Vol.42,No. 3.
21. John C Atherton (1998). H. pylori virulence factors. British Medical Bulletin, 54 (No. 1): 105-120, The British Council 1998.
22. William D. Chey, Benjamin C.Y. Wong et al (2007). American College of Gastroenterology Guideline on the Management of Helicobacter pylori Infection. American Journal of Gastroenterology. ISSN 0002¬9270.
23. Nguyễn Duy Thắng, Lê Văn Phủng, Tạ Long (2002). Phân loại HP dựa trên các gen CagA, VacA, iceA. Hội nghị tiêu hóa các nước Đông Nam Á lần thứ 4. Hà Nội 2002.
24. Mee Joo, Ji Eun Kwak, Sun Hee Chang et al (2007). Helicobacter
heilmannii-associated Gastritis: Clinicopathologic Findings and
Comparison with Helicobacter pylori-associated Gastritis. J Korean Med Sci, 22, 63-9 ISSN 1011-8934 Copyright The Korean Academy of Medical Sciences.
25. Barry J. Marshall (2005). Helicobacter connections – Nobel Lecture, December 8, 2005.
26. Quách Trọng Đức, Trần Kiều Miên (2007). Vị trí sinh thết dạ dày thích hợp trong chẩn đoán nhiễm H. pylori bằng thử nghệm Urease nhanh. Y học TP Hồ Chỉ minh. Tập 11, Phụ bản số 1.
27. Rosa Monno, Floriana Giorgio, Panella Carmine et al (2012). Helicobacter pylori Clarithromycin resistance detected by E test and Taqman real-time PCR: a comparative study. Pudmed, j.1600-0463, 2012, 02896.
28. Madhu Sharma, Preeti Mehta, Prakriti Vohra (2012). Comperative Evanluation of Diffrent Diagnostic Techniques Available for Diagnosis of H. pylori. International Journal of Scientific and Research Publications, Volume 2, Issue 12.
29. Trần Thiện Trung (2002) – Viêm loét dạ dày tá tràng và vai trò của H. pylori – NXB Y học.
30. Hôi khoa học tiêu hoa Viêt nam (2013). Khuyên cao chầm đoán vài điêu trị H. pylori tại Việt Nam . Tạp chỉ Tiêu hóa Việt Nam . Sô 743 – 2023/CXB/3-85/YH, Hà Nội.
31. Phan Quốc Hoàn (2013). Công thức, cách sản xuất urease test để chẩn đoan H. pylori. Tạp chỉ tiêu hóa, sô 30.
32. Jeh-En Tzeng, Ying-Lung Lin, Sue-Mei Chung et al (2005). Comparison of Four Diagnostic Methods for Helicobacter pylori. Tzu Chi Med J, 17,No. 5.
33. Vijaya D, Chandrashekar N, Nagarantnamma T et al (2012). Simple Stain for Helicobacter Pylori. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 2012 May (Suppl-2), Vol-6(4), 664-666.
34. Akanda MR, Rahman AN (2011). Comparative Study of Different Methods for Detection of Helicobacter Pylori in Gastric Biopsies. Dinajpur Med Col J 2011 Jan; 4.
35. D. Kobayashi, Y. Eishi, T. Ohkusa et al (2002). Gastric mucosal density of Helicobacter pylori estimated by real-time PCR compared with results of urea breath test and histological grading. J. Med. Microbiol, Vol. 51, (2002), 305-311.
36. http://www.cyto.purdue.edu/flowcvt/research/cvtotech/apopto/data/chap
3. htm. Acridine Orange Staining Protocol.
37. M. Ashton-Key, T C Diss, P G Isaacson (1996). Detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy and resection specimens. J7 Clin Pathol 1996,49,107-111.
38. Lê Trung Thọ, Trần Văn Hợp, Phạm Bình Nguyên (2007). Nghiên cứu mô bệnh học và tỷ lệ nhiễm H. pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày mạn tính. Y hoc TP. Hồ Chí Minh , Vol.11, Supplement of No.3-2007, 68¬
74.
39. Leen Jan van Doorn, Yvonne Henskenes, Nathalie Nouhan et al (2000). The efficacy of laboratory diagnosis of H. pylori infections in gastric biopsy specimens is related to bacterial density and vacA, cagA and iceA genotypes. Journal of clinical microbiology, Jan, p. 13-17. Vol.38, N0.1.
40. Michael F. Dixon, Robert M. Genta, John H. Yardley et al (1996). Classification and grading of gastritis The updated Sydney system. The American journal of surgical pathology, 20(10), 1161-1181.
41. Tokunaga Y, Shirahase H, Yamoto E et al (2000). Modified rapid urease test for H. pylori detection in relation to an immunohistochemical stain. PubMed 2000 Jun,15(6), 617-21.
42. Akhter J, Shrestha HG (2007). Rapid detection of Helicobacter pylori by endoscopic brush cytology and comparison with histopathology.
Kathmandu University Medical Journal, Vol. 5, No. 3, Issue 19, 387¬390.
43. Gurjeet Kaur, Manoharan Madhavan, Amir Hakim Basri et al (2004). Rapid diagnostic of H. pylori infection in gastric imprint smears. Malaysia Vol. 35, N0. 3, Sept 2004.
44. Mahtab Rahbar, Kaykhosro Mardanpur, Ramin Tavafzadeh (2012). Imprint cytology: a simple, cost effectiveness analysis for diagnosing Helicobacter pylori, in west of Iran. Medical Journal of Islamic Republic of Iran, Vol. 26, No. 1, Feb. 2012, pp. 12-16.
45. B. Marshall, A. J. Howat and P. A. Wright (1999). Oral fluid antibody detection in the diagnosis of Helicobacter pylori infection. J. Med. Microbiol, Vol.48, 1043-1046.
46. James T. Neal, Tracy S. Peterson, Michael L. Kent et al (2013). H. pylori virulence factor CagA increases intestinal cell proliferation by Wnt pathway activation in a transgenic zebrafish model. Disease Models & Mechanisms. 6, 802-810, doi: 10.1242/dmm,011163.
47. T L Cover, Y Glupczynski, A P Lage et al (1995). Serologic Detection of Infection with cagA1 Helicobacter pylori Strains. Journal of clinical microbiology, June 1995, p. 1496-1500, Vol. 33, No. 6.
48. Yuki Obata, Shogo Kikuchi, Hiroto Miwa et al (2003). Diagnostic accuracy of serological kits for Helicobacter pylori infection with the same assay system but different antigens in a Japanese patient population. Journal of Medical Microbiology, 52, 889-892.
49. L D Ballam, M A Mendall, M Asante et al (2000). Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol,53,314-317.
50. L P Andersen and F Espersen (1992). Immunoglobulin G Antibodies to Helicobacter pylori in Patients with Dyspeptic Symptoms Investigated by the Western Immunoblot Technique. Journal of clinical micro¬biology,, p. 1743-1751, Vol. 30, No. 7.
51. M M Alemohammad, T J Foley and H Cohen (1993) – Detection of Immunoglobulin G Antibodies to Helicobacter pylori in Urine by an Enzyme Immunoassay Method – Journal oF clinical microbiology, Aug. 1993, p. 2174-2177 Vol. 31, No. 8.
52. D Pantoflickova, D R Scott, G Sachs et al (2003). 13C urea breath test (UBT) in the diagnosis of Helicobacter pylori: why does it work better with acid test meals? Gut, 52,933-937.
53. Menachem Moshkowitz, Noya Horowitz, Anat Beit et al (2012). Gender-associated differences in urea breath test for Helicobacter pylori infection referrals and results among dyspeptic patients. World J Gastrointest Pathophysiol, 3(3), 80-84.
54. Lea Veijola, Eveliina Myllyluoma, Riitta Korpela et al (2005). Stool antigen tests in the diagnosis of Helicobacter pylori infection before and after eradication therapy. World J Gastroenterol, 11(46),7340-7344.
55. W. G. MacKay, C. L. Williams, M. McMillan et al (2003). Evaluation of Protocol Using Gene Capture and PCR for Detection of Helicobacter pylori DNA in feces. Journal oF clinical microbiology, p. 4589-4593 Vol. 41, No. 10.
56. Kim. J. M; Kim. J. S et al (2004). Distribution of antibiotic MICs for H. pylori strains over a 16 – year period in patients from Seoul, South Korea. Antimicrobial agents and Chemotherapy. p. 4843-4847. Vol. 48, No. 12.
57. Phạm Hùng Vân (2009). PCR vài realtime PCR , các vẩn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp. NXB Y hoc TP. Hồ» Chí Minh.
58. Tạ Thành Văn (2010). PCR vài môt sổ kỹ thuật y sinh học phân tư. NXB Y học.
59. 2006 Bio-rad Laboratory, Inc. All rights reserved. Real-time PCR Application Guide.
60. Yi Wei Tang, Charles W. Stratton (2006). Advaced techniques in Diagnostic Microbiology. Springer press, ISBN, 10,0-387-29741 -3.
61. Peter Malfertheiner, Francis Megraud, Colm A O’Morain et al (2012). Management of Helicobacter pylori infectiondthe Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut, 61,646e664.
62. Anthony O Connor, Javier Monila Infante, Javier P. Gisbert et al (2013). Treatment of H. pylori infection 2013. Helicobacter, ISSN, 1523-5378, John Wiley and Son Ltd.
63. Javier P Gisbert (2008). Rescue regimens after H. pylori treatment failure. World J Gastroenterol, 21, 14(35), 5385-5402.
64. Phan Trung Nam va CS (2013). Tình hình đề kháng kháng sinh của H. pylori tại khu vực miền Trung hai năm 2012 – 2013 bằng kỹ thuật: E test. Tạp chỉ khoa học tiêu hóa Việt Nam, Tập VIII, Số» 33.
65. Christine Lascol, Dominique Lamarque, Jean Marc Costa et al (2003). Fast and accurate quantitative detection of H. pylori and identification of Clarithromycin resistance mutation in H. pylori isolate from gastric biopsy specimens by real-time PCR. Journal of clinical microbiology, p. 4573-4577, Vol. 41, N0. 10.
66. Francis Mergraud, Samuel Coenen, Ann Versoporten et al (2013). Helicobacter pylori resistance to antibiotics in Europe and its relationship to antibiotic consumption. Gut, 62, 34-42, 302254.
67. Li Hui Wang, Hong Cheng, Fu Lian Hu (2010). Distribution of gyrA mutations in Fluoroquinolon resistant H. pylori strains. World J Gastroenterol, 16(18), 2272-2277, ISSN 1007-9327.
68. Lê Đình Minh Nhận, Võ Thị Chi Mai (2006). Tính đề kháng của vi khuẩn H. pylori trong bệnh viêm loét dạ dàỹ tá tràng. Tạp chỉ Y học TPHCM, Tập 10, Phụ bản số 6.
69. Nguyễn Tiến Triển dịch (2010). Cập nhật về H . pylori – Tống quan vê tình hình đề kháng kh áng sinh của H. pylori trến thế giới . Theo Vincenzo De Francesco và cs. JGastrointestin Liver, 19 (4), 409-414.
70. Nguyễn Triển dịch theo Lucia Pacifico và cs (2010). Hậu quả nhiễm H. pylori ở trẻ em – Gastroenterol, 16(41), 5181-5194.
71. Trần Thiện Trung (2012). Các quan điểm hiện nay về điều trị H. pylori. Ykhoa viet.vn.
72. Gokben Ozbey, Ibrahim Halil Bahcecioglu, Mehmet Nuri Acik (2012). Resistance Rates to Various Antimicrobial Agents of Helicobacter pylori Isolates in Eastern Turkey. International Journal of Molecular and Clinical Microbiology, 148-152.
73. Agnes Labigne and Peter J. Jenks. Helicobacter pylori: Physiology and genetic – www.ncbi.nlm.gov/books.
74. Ge Wang and Diane E. Taylor (1998). Site-specific mutation in the 23S rRNA gene of H. pylori confer two types of resistance to Marcrolid- Lincosamid-Streptogramin B antibiotics. Antimicrobial agents and Chemotherapy, p. 1952-1958, Vol. 42, N0. 8.
75. Rossella Cianci, Massimo Montalto, Franco Pandolfi et al (2006). Third-line rescue therapy for H. pylori infection. World J Gastroenterol, 12(15),2313-2319.
76. Sophia Gazi, Andreas Karameris, Marios Christoforou et al (2013). Real-time PCR detection and quantitation of H. pylori Clarithromycin resistant strains in achival material anf correlation with Sydney classification. Annals of Gastroenterology ,226-232.
77. Stephanie A. Chisholm, Rober J. Owen et al (2001). PCR-base diagnosis of H. pylori infection and real-time Determination of Clarithromycin resistance directly from human gastric biopsy samples. Journal of clinical microbiology, p. 1217-1220,Vol. 39.N0. 4.
78. Jame Versalovic, Dee Shortridge, Kirsten Kibler et al (1996). Mutation in 23S rRNA are associated with Clarithromycin resistance in H. pylori. Antimicrobial Agent and Chemotherapy, p. 477-480.
79. Monica Oleastro, Armelle Menard, Adriana Santos et al (2003). Real¬time PCR assay for rapid and accurate detection of point mutations conferring resistance to Clarithromycin in H. pylori. Journal of Clinical Microbiology, p. 397-402. Vol. 41. N0. 1.
80. Claudia S. Gurtner, Alexander M. Hirschl, Brigitte Dragosics et al (2004). Novel real-time PCR assay for detection of H. pylori infection and simultaneous Clarithromycin susceptibility testing of stool and biopsy specimens. Journal of clinical microbiology, p. 4512-4518, Vol. 42.N0. 10.
81. Jacques Tankovic, Marie Therse Lionel Defforges, Nathalie Launay et al (2007). Routine use of real-time PCR for detection of H. pylori and Clarithromycin resistance mutations. Gastroenterobiol Clin Biol, 31,792-795.
82. Josette Raymond, Christophe Burucoa (2007). Clarithromycin Resistance in Helicobacter pylori Strains Isolated from French Children: Prevalence of the Different Mutations and Coexistence of Clones Harboring Two Different Mutations in the Same Biopsy. Journal compilation, Blackwell Publishing Ltd, Helicobacter 12: 157-163.
83. M. Isabel Garcia Arata, Fernando Baquero, Luis de Rafael et al (1999). Mutation in 23S rRNA in H. pylori conferring resistance to Clarithro¬mycin. Antimicrobial Agent and Chemotherapy, p. 374-376.
84. Vicenzo de Francesco, Floriana Giorgio et al (2011). Primary Clarithromycin resistance in H. pylori: the multicentric Italian Clarithro¬mycin resistance observational (Micro) study. J Gastrointestin Liver Dis, Vol. 20, N0 3, 235-239.
85. Floriana Giorgio, Vincenzo de Francesco et al (2013). Primary Clarithromycin resistence to H. pylori: Is this the main reason for triple therapy failure? World J Gastrointest Pathophysiol, 4(3),43-46, ISSN 2150-5330.
86. Nguyễn Đúc Toàn , Nguyễn Văn Thịnh , Nguyễn Thi Nguyệt: và CS (2013). Đột biến gen củà H. pylori lien quàn đễn khàng tiễn phàt Clarithromycin ở bễnh nhân loet tà tràng. Tạp chỉ khoa học tiêu hóa Việt Nam, Tâp VII, Số 30.
87. Ngố Tât Trung, Nguyễn Húu Toàn, Tạ Long (2013). Xây dúng quy trinh xác định gen kháng Qàrithromycin củà H. pylori. Tạp chỉ khoa học tiêu hóa Việt Nam, Tâp VIII, Số 31.
88. Lúu Ngọc Hoạt (2014). Nghiên cứu khoa học trongy học – Trúờng ĐHY Hà Nội. NXB Y học.
89. Cống ty Viễt A . Hương dẫn sư dung Crush tool kit , IVA pDNA Extraction kit, LightPower iVAHP rPCR Plus Kit, LightPower iVAHP ClaR rPCR Plus Kit.
90. Dan L. Longo, Dennis L. Kasper, J. Larry Jameson et al (2013). Harrison principle of internal medicine. 18th edition – Hàrrisoris™ is à trademark of The McGraw-Hill Companies, Inc.
91. Sigma Aldrich. Giemsa stain procedure.
92. Nam khoa Biotek. Hương dẫn sư dung bô xét nghiêm real -time PCR phát hiện đột biến trên gen 23S giủp H. pylori khang Clarithromycin.
93. Trịnh Tuấn Dũng (2000). Nghiên cưu hình thai hoc của loét da day . Luân àn tiễn sy y hoc, Trưởng Đài hoc Y Hà Nối.
94. Lê Quang Tâm, Bùi Hữu Hoàng (2012). Viêm, loét dạ dày tá tràng và nhiễm H. pylori ở bệnh nhân dâ n tốc Ê đễ tài bễnh viễn tinh Đắc Lắc . Tạp chỉ tiêu hóa Việt nam, Tập 7, Số 29.
95. Trần Văn Hợp, Lê Trung Thọ (2007). Tỷ lệ nhiễm H. pylori ở bệnh nhân ung thư da dày tại Hài Nôi và khu vực nông thôn ngọài Hài Nôi. Y hoc TP Hồ Chỉ Minh. Vol. 11, Supplement of N0 3, 75 – 79.
96. Thi Thu Ha Hoang, Carina Bengtsson, Dac Cam Phung (2005). Seroprevalence of Helicobacter pylori Infection in Urban and Rural Vietnam. Clinical and diagnostic laboratory immunology. p. 81-85 Vol. 12, No. 1.
97. Cosme A Esquive, Agar R Nevarez et al (2014). Seroepidemiology of Helicobacter pylori infection in general population in a northern Mexican city – Health, 27-32.
98. Trần Thiên Trung , Nguyên Tuần Anh, Quách Hữu Lộc (2013). Giá trị chần đoàn H. pylori băng phượng phàp multiplex PCR sọ vợi Clọ test và huyêt thành. Tạp chí tiêu hóa, Tâp VIII, Sô 33.
99. Mohammad Khalifehgholi, Fereshteh Shamsipour, Hossein Ajhdarkosh (2013). Comparison of five diagnostic methods for Helicobacter pylori. IJM, Volume 5, Number 4, 396-401.
100. Meltem Yalinay Cirak,Yakut Akyon and Francis Mégraud (2007). Diagnosis of Helicobacter pylori. Helicobacter ISSN 1523-5378, Journal compilation 2007, Blackwell Publishing Ltd, Helicobacter Suppl. 1, 4-9.
101. Katarine A S Barile, Artur L C Silva et al (2010). Characteration of 23S rRNA dormain V mutations in gastric biopsy patients from the eastern Amazon. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de janero, Vol. 105(3), 314-317.
102. Đinh Càọ Minh, Bùi Hữu Hoàng (2013). Đành già đê khàng khàng sinh củà H. pylori trên bênh nhân viêm lọet dà dày tà tràng đà điêu tri tiệt; trự thât bài. Tạp chỉ tiêu hóa Việt Nam, Tầp 8, Sô 33, p. 2139.
103. Nguyên Lầm Tung, Tomohisha và CS (2010). Nhiêm khuân H. pylori và bênh dà dày tà tràng ợ Viêt Nàm: nghiên cưu căt ngàng ợ bênh viên. Tạp chí tiêu hóa Việt Nam, Tập V, Sô 20, trang 1377-1379.
104. Vincenzo de Francesco, Floriana Giorgio et al (2010). Worldwide H. pylori antibiotic resistance: a systemic review. J Gastrointestin Liver Dis, Vol. 19, N0 4, 409-414.
105. Nourkhoda Sadeghifard, Teimour Seidanazi et al (2013). Survey in Iran of Clarithromycin resistance in H. pylori isolates by PCR-RFLP. Southeast Asian J Trop Med Public health. Vol. 44, N0. 1.
106. Mohammad Kargar, Maryam Baghernejad et al. Clarithromycin resistance and 23S rRNA mutations. H. pylori, http/www.inter- chopen.com.
107. Sonia Agudo, Guillermo Perez, Teresa Alacon et al (2010). Hight prevalence of Clarithromycin-resistant H. pylori strains and risk factors associated with resistance in Madrid, Spain. Journal of clinical Microbiology, p. 3703-3707, Vol. 48, N0. 10.
108. Karolina Klesiewicz, Pawel NoWak et al (2014). PCR-RFLP detection of point mutation A 2143G and A2142G in 23S rRNA gene conferring resistance to Clarithromycin in H. pylori strains. ABP Biochemica, Vol. 61, N0 2, 311-315.
109. Sirinthornpunya S (2012). Prevalence of Helicobacter pylori infection in patients with peptic disease. Suppl 3, S22-7 PMID:22619883.
110. Monique Maria Gerrits. Molecular Mechanisms of Antibiotic Resistance in Helicobacter pylori. Optima press, ISBN, 90-9018512-7-Roche diagnostics Nederland B.V.
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TAI LIÊU 3
1.1. Đặc điểm của vi khuẩn H. pylori 3
1.1.1. Vài nét về lịch sử nghiên cứu 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học vi khuẩn H. pylori 3
1.1.3. Phân loại Helicobacter 12
1.1.4. Khả năng gây bênh cua H. pylori 12
1.1.5. Xác định tổn thương LDD-HTT qua nội soi 14
1.2. Các phương pháp xét nghiệm xác định nhiễm H. pylori hiên nay 15
1.2.1. Các test có sử dụng thủ thuật xâm lấn 15
1.2.2. Các test không sư dung thu thuật xâm lấn 19
1.3. Các kỹ thuật real-time PCR xac định H. pylori 21
1.3.1. Giơi thiêu- chung vê real-time PCR 21
1.3.2. Môt sô nghiên cưu xac đinh H. pylori sư dung real-time PCR 26
1.3.3. Các phương pháp phát hiện đột biến điểm sủngụreal-time PCR 28
1.3.4. Môt sô nghiên cưu xac đinh đôt biên điêm cua H. pylori sư dung
real-time PCR 31
1.4. Các phac đô diêt H. pylori và sự kháng kháng sinh của vi khuẩn 31
1.4.1. Các phác đồ điều trị diệt H. pylori 31
1.4.2. Khả năng kháng clarithromycin của H. pylori 31
1.4.3. Môt sô nghiên cưu đôt biên khang clarithromycin cua H. pylori sử
dụng real-time PCR 34
1.5. Thông tin sơ lược về địa điểm tổ chức nghiên cứu 37
CHƯƠNG 2: ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.1. Đia điêm va đôi tương nghiên cưu 38
2.1.1. Đia điêm, thời gian nghiên cưu 38
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 38
2.1.3. Vât liêu nghiên cứu 38
2.2. Phương pháp nghiên cứu 39
2.2.1. Thiêt kê nghiên cứu 39
2.2.2. Cơ mâu vá cách chọn mâu 40
2.2.3. Các kỹ thuật trọng nghiên cứu 41
2.2.4. Sơ đồ nghiên cứu 46
2.2.5. Các chỉ tiêu trọng nghiên cứu 46
2.2.6. Phương pháp thu thâp thông tin 48
2.2.7. Các sái số và khống chế sái số 48
2.2.8. Phương pháp phân tích vá xứ lý sô liêu 48
2.2.9. vân đê đáọ đức trọng nghiên cứu 49
CHƯƠNG 3: KẾT QUA NGHIÊN CỨU 50
3.1. Xác định H. pylori trọng mánh sinh thiêt dá dáý bằng k ỹ thuật real-time PCR 50
3.1.1. Tỷ lệ nhiễm H. pylori trong nghiên cứu 50
3.1.2. Phân bô tý lê nhiêm H. pýlọri theọ đô tuôi 51
3.1.3. Phân bô tý lê nhiễm H. pýlọri theọ giơi 52
3.1.4. Phân bô tý lê nhiễm H. pýlọri theọ địá dứ 52
3.1.5. Kêt quá reál-time PCR H. pylori trọng LDD đơn thuân, lọét DD-
HTT vá LHTT đơn thuân 53
3.1.6. Tỷ lệ nhiễm Hpylori và vị trí ổ loét dạ dàý ơ bênh nhân lọet dá dàý. 54
3.1.7. Tỷ lệ nhiễm Tpylori và vị trí ổ loét dạ dàý ơ bênh nhân lọet DDTT. . 54
3.1.8. Tỷ lệ nhiễm Hpylori với các hình thái lọét HTT ơ bênh nhân HTT. 55
3.1.9. Tỷ lệ nhiễm Tpylori với hình thái lọét HTT ơ bênh nhân lọet- DDT. 55
3.1.10. Tỷ lệ nhiễm H. pýlọri vá tình trạng bệnh nhân sử dụng kháng sinh
dứơi 4 tuần trứơc nôi sọi 56
3.1.11. Tỷ lệ nhiễm H. pýlọri vá sô lân điêu tri bênh DD-HTT 57
3.2. Xác định tỷ lê có» đôt biến đê khang clarithromycin 57
3.2.1. Tỷ lệ H. pylori có» đôt biến 57
3.2.2. Tỷ lệ H. pylori đôt biến kháng clarithromycin theo đô tuôi 58
3.2.3. Tỷ lệ H. pylori đôt biến kháng clarithromycin theo giới tính 59
3.2.4. Tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin theo địa dư 59
3.2.5. Tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin và tình trạng sử dụng kháng
sinh điếu tri H. pylori 60
3.2.6. Tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin với tình trạng sử dụng kháng
sinh cu thế theo cac phac đô 61
3.2.7. Tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin và tình trạng sử dụng kháng
sinh dưới 4 tuần trước khi nôi soi 62
3.2.8. Tỷ lệ các kiểu đột biến trong nghiến cưu 63
3.2.9. Tỷ lệ các vị trí đột biến 63
3.2.10. Tỷ lệ các kiểu thay thế nucleotid 64
3.2.11. Tỷ lệ các chủng mang một hay nhiều đột biến 64
3.2.12. Tỷ lệ các kiểu phối hợp đột biến trong một chủng H. pylori 65
3.2.13. Tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin trong LDD đớn thuần, loét
DD-HTT va LHTT đớn thuần 67
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 68
4.1. Xác định H. pylori trong manh sinh thiết da day bằng ky thuầt real¬time PCR 68
4.1.1. Tỷ lệ nhiễm H. pylori cua bếnh nhần trong nghiến cưu bằng xet
nghiếm real-time PCR 68
4.1.2. Tỷ lệ nhễm H. pylori trong cac đôi tướng nghiến cưu theo đô tuổi70
4.1.3. Phần bô ty lế nhiễm H. pylori theo giới tính 70
4.1.4. Tỷ lệ nhiễm H. pylori theo đia dư 71
4.1.5. Tỷ lệ nhiễm H. pylori va cac hinh thai loet ớ DD-HTT 72
4.1.6. Đặc điểm ổ loét DD-HTT vải kết quả xét nghiêm real-time PCR xảc
định H. pylori 72
4.1.7. So sảnh kết quả real-time PCR xảc định H. pylori vả tinh trang sử
dụng kháng sinh dửới 4 tuần trửởc nôi soi 73
4.1.8. Tỷ lệ nhiễm H. pylori vả sô lần mắc bênh DD-HTT 74
4.2. Tỷ lệ đôt biến khảng clảrithromycin củả cảc chung H. pylori phần lầp đửơc ở cảc bênh nhần loet DD – HTT trong nghiến cửu 75
4.2.1. Tỷ lệ chung các chung HI pylori co đôt biến khảng clảrithromycŨÍ75
4.2.2. Tỷ lệ đột biến kháng clảrithromycin vả các yếu tô tuôi, giởi tinh,
vùng địả dử 77
4.2.3. Tỷ lệ H. pylori đôt biến khảng clảrithromycin vởi tinh trạng sử
dụng kháng sinh 78
4.2.4. Tỷ lệ các kiểu và các loại đột biến kháng clảrithromycin 79
4.2.5. Tỷ lệ đột biến kháng clảrithromycin trong LDD đởn thuần, loét
DD-HTT vả LHTT đởn thuần, 84
KẾT LUÂN 85
KIẾN NGHI 86
TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
Bảng 1.1. Mốt số tính chất sinh vất hóa học củaH. pylori 4
Bảng 1.2. Các gen của H. pylori, năm nghiên cứu, kỹ thuật dùng nghiên cứu. 27
Bảng 1.3. Các phác đồ diệt H. pylori 31
Bảng 1.4. Tỷ lệ các kiểủ đột biến kháng clarithromycin 34
Bảng 2.1. Mô ta đặc tính mối kit real-time PCR xac định H. pylori 39
Bảng 2.2. Sơ đố mix cac chứng dương va chứng ấm 44
Bảng 2.3. Sơ đố mix cac mấủ phat hiên đốt biên kháng clarithrómycin 44
Bảng 3.1. Phấn bố ty lê nhiêm H. pylori theo đố tủối 51
Bảng 3.2. Tình trạng sử dụng kháng sinh dưới 4 tủấn trươc nối soi trong cac
bênh nhấn nghiên cứủ 53
Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm H. pylori và vị trí ổ loét dạ dày Ơ bênh nhấn loet da
dày 54
Bảng 3.4. Tỷ lệ H. pylori đốt biên khang clarithromycin theo đốủối 58
Bảng 3.5. Tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin với tình trạng sử dụng kháng
sinh theo cac phac đố 61
Bảng 3.6. Tỷ lệ các kiểủ phối hợp đột biến trong một chủng pylori 65
Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ nhiễm H. pylorri trong nghiên cứu 50
Biểu đồ» 3.2. Phân bổ» tỷ lê nhiễm H. pylori theo giới 52
Biểu đồ» 3.3. Phân bồ» tỷ lễ nhiễm H. pylori theo địa dư 52
Biêu đồ» 3.4. Kễt qua real-time PCR H. pylori trong các bệnh 53
Biểu đồ» 3.5. Tỷ lệ nhiễm H. pylori và vị trí ổ loét dạ dàỷ ớ bệnh nhân loet
DD – HTT 54
Biểu đồ» 3.6. Tỷ lệ nhiễm H. pylori với các hình thái loét HTT ớ bệnh
nhân loet HTT 55
Biểu đồ» 3.7. Tỷ lệ nhiễm H. pylori với hình thái loét HTT ớ bệnh nhân
loét DD – HTT 55
Biểu đồ» 3.8. Tỷ lệ nhiễm H. pylori và tình trạng bệnh nhân sử dụng
kháng sinh dưới 4 tuần trước nồi soi 56
Biểu đồ» 3.9. Tỷ lệ nhiễmH. pylori và số lần điều trị bệnh DEHTT 57
Biểu đồ» 3.10. Tỷ lệ H. pylori có đột biến 57
Biểu đồ 3.11. Tỷ lệ H. pylori đột biển kháng clarithromycin theo giới tính 59 Biểu đồ 3.12. Tỷ lể H. pylori có đột biến kháng clarithromycin theo địa dư5 9 Biểu đồ» 3.13. Tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin và tình trạng sử dụng
kháng sinh điểu tri H. pylori 60
Biểu đồ» 3.14. Tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin và tình trạng sử dụng
kháng sinh dưới 4 tuân trước khi mi soi 62
Biểu đồ 3.15. Tỷ lệ các kiểu đột biến trong nghiển cứu 63
Biểu đồ» 3.16. Tỷ lệ các vi trí đồt biển 63
Biểu đồ» 3.17. Tỷ lệ các kiểu thaỷ thể nucleotid 64
Biểu đồ» 3.18. Tỷ lệ các chủng H. pylori mang cac đồt biển 64
Biểu đồ» 3.19. Tỷ lệ đột biến kháng clarithromycin trong LDD đớn thuần,
loét DD-HTT và LHTT đớn thuân 67 
Real-time PCR dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EvaGreen 22
Kỹ thuật real-time PCR với mẫu dò Taqman 25
Kỹ thuật real-time với mẫu dò beacon 25
Hoạt động của probe lai 26
Mồi bắt cặp với đột biến 29
Mầu dò bắt cặp với đột biến 29
Cơ chế xac đinh khac biệt: alen dùng Taqman probe 30
Cấu truc va hoạt: động cua MGB Taqman probe 30
Một mấu sinh thiết co kết qua real-time PCR duơng tính truơc chu ky 30 51
Một mấu co kết qua đột biến điếm tá2 vị trí A2142G, A2143G …. 58 Mấu bếnh phấm sộ 86 có 4 kiếu đột biến phội hợp Duơng Ơ chu
kỳ 33 66
Mấu bếnh phấm sộ 139 vơi 3 kiếu đột biến phội hợp Duơng ợ chu kỳ 34 66