Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan
Luận văn Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan.Ung thư gan hiện là một trong các loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới và Việt Nam, đây là bệnh ung thư có tỷ lệ tử vong cao, hơn nữa, tỷ lệ mắc bệnh đang có xu hướng tăng lên. Theo thống kê năm 2008, ước tính trên thế giới có khoảng 748.300 trường hợp mắc ung thư gan và 695.900 ca tử vong do ung thư gan. Việt Nam thuộc khu vực Đông Nam Á là nơi có tỷ lệ mắc ung thư gan cao nhất [18]. Theo thống kê của bệnh viện K, nước ta có tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát cao do nhiễm virus viêm gan B và virus viêm gan C [41]. Do đó, việc nghiên cứu về tác nhân gây bệnh, cơ chế và phương pháp chẩn đoán, phát hiện sớm ung thư gan có vai trò quan trọng đối với việc giảm tỷ lệ mắc và giảm tỷ lệ tử vong ở loại ung thư này.
Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan Hiện nay, các phương pháp xét nghiệm lâm sàng như: sinh thiết gan, chụp cắt lớp vi tính, siêu âm chẩn đoán hình ảnh và xác định các chỉ thị sinh học như anpha fetoprotein là các “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán ung thư gan. Tuy nhiên, các xét nghiệm này có nhiều hạn chế do chỉ phát hiện được bệnh vào giai đoạn muộn làm giảm khả năng sống sót của bệnh nhân ung thư gan [38]. Nhu cầu đặt ra là phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học mới giúp chẩn đoán, phát hiện ung thư gan ở giai đoạn sớm.
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm kiếm các chỉ thị ung thư gan sử dụng công cụ proteomics. Phần lớn các protein có trong huyết tương đều được tổng hợp từ gan. Mô gan của bệnh nhân ung thư gan cũng có khả năng tổng hợp nhiều protein liên quan đến khối u. Do đó, các tín hiệu protein trong mô gan có thể dùng làm công cụ để chẩn đoán sự tiến triển của bệnh gan, phát triển chẩn đoán phân tử [29]. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các protein nội bào có liên quan đến quá trình hình thành khối u, kích thích đáp ứng miễn dịch sinh ra các tự kháng thể [26] và nhiều kháng nguyên ung thư đã được xác định trong cơ thể bệnh nhân ung thư [27]. Vì thế, các tự kháng thể có thể được dùng để chẩn đoán lâm sàng ung thư và dùng trong phân tích proteomics để nhận dạng các kháng nguyên liên quan đến khối u có khả năng liên quan đến sự chuyển
dạng ác tính của tế bào. Đây là hướng nghiên cứu mới nhằm tìm kiếm các chỉ thị sinh học ung thư liên quan đến đáp ứng miễn dịch.
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan” nhằm mục đích:
– Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thư so với mô gan bình thường của bệnh nhân ung thư gan thông qua các điểm protein trên bản gel điện di hai chiều.
– Nhận dạng được một số protein khác biệt đặc trưng giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường.
– Xác định được protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thư gan) đặc hiệu với các kháng thể trong huyết tương bệnh nhân ung thư gan.
Đề tài được thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
MỤC LỤC Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT a
DANH MỤC CÁC BẢNG d
DANH MỤC CÁC HÌNH e
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 – TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ GAN 3
1.1.1. Phân loại ung thư gan nguyên phát 3
1.1.2. Nguyên nhân dẫn tới ung thư gan 4
1.1.3. Các giai đoạn của ung thư gan 6
1.1.4. Các phương pháp chẩn đoán ung thư gan 8
1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƯ 9
1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thư 9
1.2.2. Tiếp cận nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thư 10
1.2.3. Các loại chỉ thị sinh học đối với ung thư gan 11
1.3. MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƯ 13
1.3.1. Đáp ứng miễn dịch chống ung thư 13
1.3.2. Kháng nguyên ung thư 13
1.3.3. Chỉ thị ung thư liên quan đến đáp ứng miễn dịch 14
1.4. NGHIÊN CỨU PROTEOMICS MIỄN DỊCH UNG THƯ GAN 15
1.4.1. Khái quát về proteomics và ứng dụng của proteomics 15
1.4.2. Hệ protein gan người 16
1.4.3. Nghiên cứu proteomics miễn dịch ung thư gan 17
Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24
2.1. NGUYÊN LIỆU 24
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 24
2.1.2. Hóa chất 24
2.1.3. Thiết bị 25
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.2.1. Xử lý mẫu mô gan 25
2.2.2. Định lượng protein theo phương pháp Bradford 27
2.2.3. Điện di hai chiều 27
2.2.4. Western Blot 28
2.2.5. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, kết quả Western Blot 29
2.2.6. Cắt và thủy phân spot trên bản gel điện di hai chiều 30
2.2.7. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein 31
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33
3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN 33
3.2. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU 34
3.2.1. Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều 34
3.2.2. Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều 36
3.3. NHẬN DẠNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS 41
3.4. THẨM TÁCH MIỄN DỊCH – WESTERN BLOT HAI CHIỀU 44
3.4.1. Xác định tỷ lệ pha loãng kháng thể bậc một thích hợp 44
3.4.2. Kết quả Western Blot hai chiều 46
3.5. ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT ….47
3.5.1. Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis 50
3.5.2. Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể 52
3.5.3. Protein tham gia cấu trúc tế bào 53
3.5.4. Protein tham gia các quá trình trao đổi chất 54
3.5.5. Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã và cải biến 55
3.5.6. Protein có phản ứng miễn dịch với huyết tương 56
KẾT LUẬN 60
KIEN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO 62
PHỤ LỤC i
Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân ung thư tê bào gan i
Phụ lục 2. Phân tách protein mô gan của 5 bệnh nhân HCC trên bản gel điện di hai chiều ii
Phụ lục 3. Kêt quả nhận dạng protein bằng cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng phần mềm Mascot vi
Phụ lục 4. Kêt quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của 3 bệnh nhân HCC viii
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Alpha-1 -antitrypsin Ammonium bicarbonate Acetonitrile Beta-actin Alpha fetoprotein Aflatoxin Bl Cathepsin D
3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid
a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid
Cộng sự
Dalton
Dithiothreitol
Enzyme-linked immunosorbent assay
(Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme)
Glutamine synthetase
Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)
Hepatitis B surface Antigen (Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B)
Hepatocellular carcinoma (Ung thư tế bào biểu mô gan)
Hepatitis C virus (Virus viêm gan C)
Human Liver Proteome Project (Dự án Proteome gan người) Haptoglobin
Human Proteome Organisation (Tổ chức Proteome người)
Horse – radish peroxidase
a
Heat shock protein (Protein sốc nhiệt)
Iodoacetamide
Isoelectric Focusing (Điện di phân vùng đẳng điện)
Immobilized pH gradient (Gradient pH cố định)
Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng kết nối với khối phổ)
Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight Microfibrillar-associated protein 3 Mayjor Histocampatibility Complex (Phức hệ phù hợp tổ chức mô chủ yếu)
Mass spectrometry (Khối phổ)
Molecular weight (Khối lượng phân tử)
Phosphate Buffer Saline (Đệm muối phosphate)
Proliferating cell nuclear antigen
Protein disulfide-isomerase
Protein disulfide-isomerase A3
Peptide Mass Fingerprint (Đặc trưng khối peptide)
Phenylmethanesulfonyl fluoride
Polyvinylidene fluoride
Cellular tumor antigen p53
Sodium dodecyl sulfate
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di trên gel polyacrylamide có SDS)
Serological Analysis of Recombinant cDNA Expression Libraries (Phân tích huyết thanh bằng thư viện biểu hiện cDNA tái tổ hợp)
Superoxide dismutase [Cu-Zn]
b
SODM Superoxide dismutase [Mn]
Mn-SOD Manganese superoxide dismutase
Spot Điểm protein
ST7L Suppressor of tumorigenicity 7 protein-like
TAA Tumour Associated Antigen (Kháng nguyên liên quan đến ung thư)
TAP Transporters of Antigen Peptide
(Phân tử vận chuyển peptide kháng nguyên)
TFA Trifluoroacetic acid
TNM Tumor Node Metastasis
(Kích thước khối u – Hạch Lympho – Di căn)
TSA Tissue Specific Antigen (Kháng nguyên đặc hiệu mô)
TSTA Tumour Specific Transplantation Antigen (Kháng nguyên ghép đặc hiệu ung thư)
c
Bảng 1. Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng bệnh ung thư gan 7
Bảng 2. Các chỉ thị ung thư gan mới được công bố (20 năm gần đây) 12
Bảng 3. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu 24
Bảng 4. Các bước chạy điện di đẳng điện trên thanh strip dài 7cm và 17cm 28
Bảng 5. Tổng số spot trên mỗi bản gel điện di hai chiều 36
Bảng 6. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan
bình thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 – 10 39
Bảng 7. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 – 7 39
Bảng 8. Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thư so với mô gan bình thường được xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL 40
Bảng 9. Danh sách các protein được xác định bằng MALDI-TOF MS từ bản gel mô gan ung thư so sánh với mô gan đối chứng của bệnh nhân HCC 42
Bảng 10. Tóm tắt chức năng chính của các protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan đối chứng đã đươc nhận dạng 48
d
Hình 1. Ung thư gan xuất phát từ chính tế bào gan 3
Hình 2. Cơ chế gây ung thư của các tác nhân ung thư gan 5
Hình 3. Quy trình chiết protein từ mô gan 26
Hình 4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix .30
Hình 5. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thường và mô gan ung thư trên gel polyacrylamide 10% có SDS 33
Hình 6. Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều 35
Hình 7. Hình ảnh 3-D của spot trên bản gel điện di hai chiều 37
Hình 8. Minh họa các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thư so với bản gel mô bình thường 37
Hình 9. Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu mô gan ung thư so với mô gan bình thường của bệnh nhân HCC mã 8935 38
Hình 10. Phân tích khối phổ các peptide thu được sau khi thủy phân spot protein C-256-B bằng trypsin 41
Hình 11. Phân tách protein chiết từ mô gan bệnh nhân HCC trên gel polyacrylamide và màng PVDF chuẩn bị cho phản ứng Western Blot 45
Hình 12. Kết quả phản ứng Western Blot khi ủ màng với dung dịch kháng thể bậc 1 có độ pha loãng khác nhau 45
Hình 13. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của bệnh nhân 8977 47
Hình 14. Tỷ lệ các nhóm protein tham gia vào các quá trình sinh học khác nhau …50
Hình 15. Sơ đồ nhận diện kháng nguyên nhờ protein MHC lớp I 58