Xác định người lành mang gen và chẩn đoán trước sinh bệnh thoái hóa cơ tủy

Bệnh thoái hóa cơ tủy (SMA-Spinal Muscular Atrophy) được mô tả đầu tiên bởi nhà thần kinh học Guido Werdnig, người Australia. Đây là một trong những bệnh lý thần kinh cơ di truyền thường gặp với tần xuất bệnh khá cao ở Việt Nam và thế giới, tỷ lệ mắc bệnh (1/10.000-1/25.000) [8], [50], [77]. SMA là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể (NST) thường số 5. Đột biến gen gây thoái hóa tuần tiến tế bào thần kinh sừng trước tủy sống dẫn đến suy yếu và thoái hóa đối xứng gốc chi [50]. Trên lâm sàng, bệnh nhân giảm vận động tiến triển với các đặc trưng nhược cơ đối xứng gốc chi, trương lực cơ giảm, phản xạ gân xương giảm hoặc mất, lưỡi rung, biến dạng lồng ngực và cứng khớp. Đặc điểm khác biệt so với một số bệnh lý thần kinh cơ di truyền khác bệnh nhân SMA không có biểu hiện rối loạn cơ tròn hoặc rối loạn cảm giác, trí tuệ phát triển bình thường. Dựa vào mức độ nặng nhẹ của bệnh trên lâm sàng và tuổi xuất hiện, bệnh SMA được chia làm 3 typ, trong đó typ I và typ II là thể bệnh rất nặng chiếm 3/4 các trường hợp, bệnh nhân thường tử vong sớm trong năm đầu tiên sau sinh hoặc muộn hơn ở lứa tuổi đi học do biến chứng viêm phổi và suy hô hấp [9].

Bệnh SMA có biểu hiện bệnh nặng, tỷ lệ tử vong cao, để lại di chứng nặng nề, bệnh không chỉ là nỗi thống khổ của bệnh nhân mà còn là gánh nặng cho gia đình và xã hội.

Nguyên nhân gây bệnh SMA là do đột biến gen SMN1 (survival motor neuron), rất nhiều nghiên cứu cho thấy khoảng 94% bệnh nhân SMA có đột biến xoá đoạn exon 7, exon 8 gen SMN1; khoảng 5-6% có đột biến điểm trên gen SMN1 [8], [120], [122]. Đột biến xóa đoạn là dạng đột biến dễ xác định, đột biến điểm khó xác định hơn do các dạng đột biến này không tập trung vào một số vị trí đặc hiệu mà nằm rải rác khắp chiều dài của gen.

Bệnh SMA có tỷ lệ người lành mang gen bệnh cao (1/50), nguy cơ mắc bệnh trong cộng đồng cũng rất lớn (1/10.000 trẻ). Hiện nay, chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu cũng như chưa có biện pháp làm giảm sự tiến triển của bệnh. Bởi vậy, việc chan đoán người lành mang gen bệnh, chan đoán trước sinh đang được ưu tiên lựa chọn, nhờ đó có thể tư vấn cho người mẹ có giải pháp thích hợp làm giảm tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng [8], [11], [13].

Các nghiên cứu về bệnh SMA trên thế giới đã thu được nhiều kết quả mang tính đột phá, từng bước làm sáng tỏ cơ chế phân tử của bệnh, tiến tới liệu pháp điều trị gen. Đây là công việc rất khó khăn, hầu hết các kết quả về liệu pháp điều trị gen mới chỉ đạt được mức độ nghiên cứu trên tế bào và trên động vật thử nghiệm, nhưng mở ra nhiều triển vọng điều trị bệnh SMA. Tuy vậy, các nhà khoa học nghiên cứu về bệnh SMA đều thống nhất quan điểm rằng, cho tới khi chưa tìm ra được phương pháp điều trị có hiệu quả thì những nỗ lực nghiên cứu nhằm chan đoán bệnh, phát hiện người lành mang gen bệnh trong gia đình bệnh nhân và chan đoán trước sinh những thai phụ có nguy cơ cao để tư vấn di truyền là biện pháp cơ bản phòng ngừa bệnh SMA. Xuất phát từ thực tiễn đó đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu:

1. Xác định đột biến xóa đoạn exon 7, exon 8 gen SMN1 ở bệnh nhân SMA.

2. Phát hiện người lành mang gen bệnh (bố, mẹ và anh, chị, em ruột) trong gia đình bệnh nhân đã được xác định có đột biến xóa đoạn exon 7, exon 8 gen SMN1.

3. Bước đầu chẩn đoán trước sinh cho thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh SMA.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh 3

1.2. Đặc điểm của bệnh SMA 4

1.2.1. Đặc điểm lâm sàng 4

1.2.2. Xét nghiệm cận lâm sàng 9

1.2.3. Tần suất mắc bệnh SMA 10

1.2.4. Di truyền học và bệnh học phân tử bệnh SMA 10

1.2.5. Điều trị bệnh SMA 18

1.2.6. Phòng bệnh SMA 22

1.3. Các phương pháp phát hiện đột biến gen SMN1 22

1.3.1. PCR đơn mồi 22

1.3.2. PCR- Single Strand Conformation Polymorphism 23

1.3.3. Phương pháp PCR – Restriction Fragment Length Polymorphism…. 24

1.3.4. Real – time PCR 24

1.3.5. Kỹ thuật MLPA 26

1.3.6. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp biến tính 27

1.3.7. Kỹ thuật giải trình tự gen bằng máy tự động 27

1.4. Chẩn đoán trước sinh bệnh SMA 28

1.4.1. Phương pháp chẩn đoán trước sinh lấy mẫu can thiệp thai 28

1.4.2. Phương pháp lấy mẫu không can thiệp thai 30

1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh SMA ở Việt Nam 36

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1. Đối tượng nghiên cứu 38

2.2. Trang thiết bị, dụng cụ nghiên cứu và hóa chất 39

2.2.1. Trang thiết bị nghiên cứu 39

2.2.2. Hóa chất nghiên cứu 40

2.3. Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu 42

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu 42

2.3.2. Quy trình lấy mẫu 42

2.3.3. Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi và từ tế bào ối 43

2.3.4. Xác định đột biến xóa đoạn exon 7, exon 8 trên gen SMN1 44

2.3.5. Phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật MLPA 46

2.3.6. Chẩn đoán trước sinh bệnh SMA 50

2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 53

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 55

3.1. Kết quả tách chiết DNA 55

3.2. Kết quả xác định đột biến exon 7, exon 8 của gen SMN1 56

3.2.1. Kết quả xác định đột biến xóa đoạn exon 7 gen SMN1 56

3.2.2. Kết quả xác định đột biến xóa đoạn exon 8 gen SMN1 58

3.2.3. Kết quả bệnh nhân có đột biến exon 7 mà không có đột biến exon 8

gen SMN1 59

3.2.4. Kết quả về tỷ lệ đột biến xóa đoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1… 60

3.2.5. Kết quả phân bố exon bị đột biến 61

3.3. Kết quả xác định người lành mang gen bệnh 61

3.3.1. Kết quả phân tích nhóm đối chứng 61

3.3.2. Kết quả phân tích gen của các gia đình bệnh nhân SMA 62

3.3.3. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh 70

3.4. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh SMA 71

3.4.1. Kết quả chẩn đoán trước sinh thai phụ số 1 71

3.4.2. Kết quả chẩn đoán trước sinh thai phụ số 2 73

3.4.3. Kết quả chẩn đoán trước sinh thai phụ số 3 75

3.4.4. Kết quả chẩn đoán trước sinh thai phụ số 4 ll

3.4.5. Kết quả chẩn đoán trước sinh thai phụ số 5 19

3.4.6. Kết quả chẩn đoán trước sinh thai phụ số 6 Si

3.5. Kết quả chẩn đoán sau sinh S3

Chương 4: BÀN LUẬN S4

4.1. về quy trình kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi và tế bào ối… S4

4.2. về kết quả xác định đột biến xóa đoạn gen SMNi S1

4.3. về kết quả xác định người lành mang gen bệnh 91

4.4. về kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh SMA 105

KẾT LUẬN 112

KIẾN NGHỊ 113

MỘT SỐ CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC