Xác định sự phân bố một số gen quy định yếu tố độc lực của các Escherichia coli gây tiêu chảy

Tiêu chảy là một bệnh thường gặp ở cả các nước đã và đang phát triển. Các căn nguyên gây tiêu chảy gồm vi khuẩn, virut và ký sinh trùng. Trong số các căn nguyên gây tiêu chảy, E. coli đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà vi sinh, bác sĩ lâm sàng và nhi khoa vì nó chiếm từ 20 – 30% trong số các căn nguyên xác định được từ phân tiêu chảy [4; 5]. Các DEC được chia thành 5 nhóm chính dựa trên đặc điểm lâm sàng, dịch tễ, týp huyết thanh và đặc biệt là sự có mặt của các yếu tố độc lực. Trong đó, các yếu tố độc lực có ý nghĩa quyết định. Chúng là
E.    coli    bám    dính    kết    tập    đường    ruột (enteroaggregative E.  coli – EAEC), E.  coli gây xuất huyết đường ruột (enterohaemorrhagic E. coli
–    EHEC),   E.   coli   xâm   nhập   đuờng    ruột (enteroinvasive E. coli – EIEC), E. coli gây bệnh lý đường ruột (enteropathogenic E. coli – EPEC), và E. coli sinh độc tố ruột (enterotoxigenic E. coli
–    ETEC) [4]. Mỗi một loại E. coli gây tiêu chảy kể trên đều có một hoặc một số gen (gen độc  lực) nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid,  mã  hoá cho các yếu tố độc lực. Chúng có thể  là độc tố ruột (LT, ST, EAST1), yếu tố bám  dính (intimin, lông bám dính, protein  dispersin…), yếu tố liên quan đến sự kháng kháng sinh của vi khuẩn (gen sinh ESBL…) [2; 4; 7]. Việc phát hiện sự có mặt của các gen  quy định những yếu tố này có ý nghĩa quan trọng trong xác định các E. coli gây tiêu chảy,  cơ chế gây bệnh của chúng, dịch tễ học phân tử, sự kháng kháng sinh. Thêm vào đó, nghiên cứu các gen độc lực này là cơ sở cho việc phát  triển  vacxin phòng tiêu  chảy  do  E.  coli. Chính vì những lý do trên, nghiên cứu này được thực hiện nhằm hai mục tiêu:
1.    Xác định sự có mặt của một số gen  độc lực ở các E. coli gây tiêu chảy.
2.    Xác định sự phân bố một số gen độc lực ở các E. coli gây tiêu chảy.
I.    ĐỐI  TƯỢNG,  VẬT  LIỆU  VÀ  PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Đối tượng nghiên cứu
+ 161 chủng E. coli phân lập từ phân của trẻ dươí 5 tuổi (bị tiêu chảy và không tiêu chảy) sống ở Hà Nội, gồm 86 chủng EAEC, 11 chủng EIEC, 50 chủng EPEC và 14 chủng ETEC.
+  100  chủng  E.  coli  đã  được  xác  định  là không gây tiêu chảy bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu [5].
+ Chủng E. coli làm chứng dương và chứng âm E. coli 17 – 2 và E. coli 11775 do GS. Andrej Weintraub,  khoa  Vi  sinh  lâm  sàng,  viện Karolinska, Thụy Điển cung cấp.Vật  liệu  nghiên  cứu:  sinh  phẩm,  hoá  chất dùng cho nuôi cấy, phân lập vi khuẩn, PCR
2.    Phương pháp nghiên cứu
+ Kỹ thuật PCR phát hiện gen eltB, estA, vt1, vt2, eaeA, ial, bfpA, pCVD, aap, aggR và astA được áp dụng theo mô tả của Trung [5], Yamamoto, Cerna và cộng sự [7; 1]. Kỹ thuật được thực hiện tại Labo Sinh học phân tử, bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y Hà Nội. Quy trình PCR được thực hiện trên máy GeneAmp PCR system 9700 AB (Applied Biosystem, USA). 10 μl sản phẩm PCR được dùng để điện di trên gen agarose 1,2% trong dung dịch đệm TAE ở hiệu điện thế 120 mV trong 30 phút bằng máy điện di. Các mẫu nghiên cứu được điện di cùng với chứng dương, chứng âm và thang ADN chuẩn để đối chiếu kết quả. Bản gen sau khi điện di được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide 1% trong 10 phút. Vớt bản thạch ra rồi ngâm vào nước cất 10 phút, sau đó đọc dưới máy soi gen Wealtec Corp Model – 20 (USA).
+ Phân tích số liệu: các số liệu được quản lý và phân tích bằng chương trình SPSS 13. Test ÷2 được sử dụng để đánh giá sự khác biệt giữa hai tỷ lệ. Giá trị p < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
Có năm loại E. coli gây tiêu chảy đã được xác định: EAEC, EHEC, EIEC, EPEC và ETEC. Các gen quy định yếu tố độc lực (bám dính, độc tố, kháng kháng sinh…) có vai trò quan trọng trong cơ chế gây bệnh của các E. coli gây tiêu chảy. Việc xác định các gen này có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán, nghiên cứu dịch tễ học và sản xuất vacxin. Mục tiêu: xác định sự phân bố của một số gen quy định các yếu tố độc lực ở các chủng DEC và E. coli không gây tiêu chảy. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 161 chủng E. coli gây tiêu chảy thuộc bốn loại EAEC, EIEC, EPEC, ETEC và 100 chủng E. coli không gây tiêu chảy. Kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để phát hiện các gen này. Kết quả: EAEC chiếm 50% số các DEC phân lập và xác định được. Các chủng EAEC mang gen aap với tỷ lệ cao nhất (96,5%), aggR (79,1%) và astA (60,5%). Số chủng mang cả 3 gen aap, aggR và astA là 37,2%. Không có chủng nào âm tính với cả 3 gen. Cả ETEC, EPEC và EIEC đều mang các gen aap, aggR và astA với tỷ lệ từ 7% đến 72,7%. Tỷ lệ mang gen aap cao nhất gặp ở EIEC (72,7%), aggR gặp ở EIEC (45,5%), và astA ở ETEC (50%). 14% các chủng E. coli được coi là không gây tiêu chảy mang gen aggR và trên 30% các E. coli này mang gen aap và astA. Kết luận: EAEC chiếm 50% số các E. coli gây tiêu chảy. Tỷ lệ mang gen aap cao nhất và hay gặp nhất ở các chủng EAEC. Các gen khác gặp cả ở các chủng E. coli gây tiêu chảy khác với tỷ lệ khác nhau. Kết quả của nghiên cứu có ý nghĩa trong việc phát triển vacxin phòng tiêu chảy do E. coli.